周 俊，潘丽军，韩智宏

（合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽省农产品精深加工重点实验室，安徽合肥230009）

高纯菜籽蛋白的制备及其相关性质研究

周 俊，潘丽军，韩智宏

（合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽省农产品精深加工重点实验室，安徽合肥230009）

对脱毒后的冷榨菜籽粕进行蛋白提取，超滤纯化提取液获得高纯度的蛋白成品，并研究分析了蛋白的成分、氨基酸及其功能特性。脱毒后菜籽粕中蛋白提取率为67.97%，超滤后蛋白纯度可达70%～90%。成品蛋白中植酸与硫苷未检出，多酚含量随蛋白纯度增加而显著下降，甲硫氨酸+半胱氨酸是第一限制性氨基酸，其余必需氨基酸化学评分均高于FAO/WHO标准，却大多低于全蛋蛋白标准。菜籽蛋白的持水性、吸油性、乳化性及乳化稳定性、起泡性及起泡稳定性均与蛋白纯度呈正相关。

高纯菜籽蛋白，制备，性质

菜籽是全世界产量第二的油料作物，据美国农业部（USDA）2010年8月预计，10～11年全球油菜籽产量将达5674万t，由此将产生3306万t的菜籽饼粕，其中国内占892.8万t[1]。饼粕中的蛋白是一种优质植物蛋白，含量约35%～45%，其氨基酸组成模式良好，符合FAO推荐需求[2]。菜籽蛋白水解得到的生物活性多肽具有降血压[3]以及作为HIV抑制因子的功效[4]；在各种食物配方中，不同菜籽蛋白产品也表现出令人满意的功能特性[5－6]。20世纪八十年代，加拿大开发的氨水甲醇/正己烷双液相萃取技术从菜籽中成功分离出油脂和脱毒菜籽粕[7－8]，之后Tzeng等人在此基础上又建立了以膜分离技术为核心的菜籽蛋白制备法，包括碱提、等电点沉淀、超滤、渗滤、干燥五个关键步骤，可获得纯度＞90%的两类菜籽蛋白，产品低植酸（＜1%），无硫苷（＜2μmol/g）[9]。与此同时，国内也展开对菜籽饼粕制取分离蛋白及浓缩饲用蛋白的应用研究，这些研究工作的开展为菜籽饼粕的资源利用奠定了一定基础[10]。不过目前中国在菜籽蛋白的开发应用方面仍以实验室研究居多，产业化方面的实施较少，至今大部分仍作为饲料或肥料利用。这是由于传统菜籽制油采用的高温预榨工艺造成蛋白质变性，以及饼粕中硫苷、植酸、单宁等抗营养物质的存在，很难生产出质量较好的蛋白产品，因此严重制约了菜籽蛋白的商品化应用。本文在脱毒冷榨菜籽粕基础上，采用超滤精制法制备高纯菜籽蛋白，并分析了菜籽蛋白的成分、氨基酸及功能特性，为进一步深度开发利用菜籽蛋白提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

冷榨双低菜籽粕粉 安徽大平油脂有限公司，粉碎后过60目筛，水分9.91%，脂肪3.44%，植酸2.47%，蛋白38.63%；大豆分离蛋白 北京奥博星生物技术有限公司，食品级，蛋白纯度≥90%；冰乙酸、氢氧化钠、氯化钠、石油醚、浓硫酸、浓硝酸、偏钒酸铵、钼酸铵、磷酸二氢钾、氯化钯、无水碳酸钠、福林酚试剂、没食子酸、羧甲基纤维素钠、甲基红、溴甲酚绿等 均为分析纯。

SQ2119B型多功能食品加工机 上海帅佳电子科技有限公司；TH2-82A型恒温振荡器 金坛市杰瑞尔电器有限公司；RP1-G型冷热缸 温州飞翔食品机械厂；GL-20G-Ⅱ型离心机 上海安亭科学仪器厂；SS300型三足式离心机、GQ75B高速管式分离机 上海浦东天本离心机械有限公司；DGZ20/4-1型真空干燥箱 南京实验仪器厂；膜分离设备 合肥风云膜分离技术有限公司；KM100型卷式超滤膜 美国KOCH公司；LPG-5型喷雾干燥机 常州市振兴干燥设备厂；S4300氨基酸分析仪 德国SKYNM公司；DS-1型组织捣碎机 上海越磁电子科技有限公司。

1.2 检测方法

1.2.1 理化指标测定 蛋白测定：凯氏定氮法，参照GB/T 9823—2008；水分测定：常压干燥法，参照GB/ T5009.3—2003；脂肪测定：索式提取法，参照GB/ T5009.6—2003；灰分测定：碳化灼烧法，参照GB/ T5009.4—2003；粗纤维测定：介质过滤法，参照GB/ T5009.10—2003；多酚测定：Folin-Ciocalteu试剂比色法，参照ISO14502-1—2005；植酸测定：磷钼黄比色法[11]；硫苷测定：氯化钯快速比色法[12]。

1.2.2 氨基酸分析及化学评分 称取20mg蛋白试样于氨基酸水解管中，加10.00mL 6mol/L HCl，用酒精喷灯封管，置于110℃烘箱中水解22h。取出冷却，打开水解管，50℃真空干燥后，加样品稀释液10.00mL，溶液过0.45μm膜，于2mL进样瓶中供氨基酸分析仪测定用。

化学评分CS[13]参照FAO/WHO成人氨基酸需求标准（1991）[13]和全蛋蛋白标准（1984）[13]，按下式计算：

1.2.3 功能性检测

1.2.3.1 持水性WA测定[14]称取3g样品于离心管中，记录下管和样品的总质量m1，再加入25mL去离子水，持续搅拌，之后3000r/min下离心10min，离心后得到的沉淀在50℃下保持25min，称量管和样品总质量m2，则WA（%）=（m2-m1）/3×100%

1.2.3.2 吸油性FA测定[14]准确称取1g样品于离心管中，加入12mL大豆色拉油m1，放置30min后，3000r/min离心10min，称量上层大豆色拉油的重量m2，则FA（%）=（m1-m2）×100%

1.2.3.3 乳化性EC及乳化稳定性ES的测定 参照Dipak K.Dev的方法[15]，并加以改动。称取0.1g样品2份，分别分散于装有25mL蒸馏水的试管中，再加入2.5mL大豆色拉油。快速振荡5min，将两管中液体取出倒入带刻度离心管中。1000r/min离心3min，取出离心管，观察乳化情况，记下乳化层高度H1及管中液体高度H2，则EC（%）=H1/H2×100%

将上述离心管置于80℃水浴中，加热30min后，用自来水冷却至室温。再次1000r/min离心3min，取出离心管，记下乳化层高度H3及管中液体高度H4，则ES（%）=H3/H4×100%

1.2.3.4 起泡性FC及起泡稳定性FS的测定[14]配制3%的蛋白质溶液，在DS-1高速组织捣碎机中，以1000r/min的转速搅拌1min，测量泡沫体积V，则

之后每隔5min测定泡沫体积V1，则FS（%）=V1/V× 100%

1.3 蛋白制备

称取过60目筛的菜籽粕粉10kg，将其倒入已盛好脱毒剂的冷热缸中脱毒，脱毒条件在前期实验中已确立为：醋酸质量分数0.7%，提取温度48℃，液料比10∶1（v/w），提取时间1.6h。待脱毒结束，先后用三足式离心机和高速管式分离机离心料液，收集饼粕残余物于40℃真空干燥备用。将干燥好的脱毒菜籽粕进行粉碎，准确称取10g（精确到0.0001g）于250mL三角瓶中，按一定料液比加入蛋白提取剂，混匀后置于恒温振荡器中，转速设为200r/min，室温状态下按一定时间和一定次数浸提菜籽蛋白。浸提液用GL-20G-Ⅱ型离心机离心，离心速度设为6000r/min，时间10min，所得上清液即为菜籽蛋白提取液。蛋白提取率Y1及蛋白得率Y2分别按式（1）和式（2）计算：

式中：m表示10kg菜籽粕脱毒后残余粕中总蛋白质量（kg）；Y1表示脱毒菜籽粕中的蛋白提取率；Y2表示从未脱毒菜籽粕中所能提取到的蛋白量。

按照优选出的蛋白提取条件，将脱毒菜籽粕倒入已盛好蛋白提取剂的冷热缸中进行蛋白提取。所得蛋白提取液先后用三足式离心机和高速管式分离机离心，离心出的液体即为菜籽蛋白提取液。再称量30kg的蛋白提取液用截留分子量（NMWCO）=50ku的膜超滤，超滤条件：进料压力0.5～0.7MPa，超滤温度40℃。膜分离结束后，收集截留液，进行喷雾干燥，干燥条件：进风温度180～200℃，空气风压0.4～0.6MPa。干燥成品即为高纯菜籽蛋白。

2 结果与分析

2.1 菜籽蛋白提取

根据1.3的要求，对脱毒菜籽粕进行蛋白提取。菜籽蛋白提取率及得率见表1。

由表1可看出，菜籽蛋白在40g/L NaOH提取条件下，提取率最高，但从NaOH 4g/L时，提取剂与菜籽粕接触瞬间，就会导致提取液颜色加深，随着NaOH浓度越来越高，颜色越来越深，这明显不符合所期望的蛋白颜色。此外据报道，用碱液处理蛋白类物料会生成可能对人体有毒性的赖丙氨酸（lysinoalanine）。Deng等人详细证明了严格控制蛋白提取条件的必要性，碱提菜籽蛋白不推荐在长时间、高pH（＞12）下接触进行[6]。盐提虽然所得菜籽蛋白色泽较好，但提取率低，且NaCl使用量大大超过NaOH，而后续菜籽蛋白膜分离纯化中，超滤若不完全会导致一部分盐残留在蛋白中，造成蛋白纯度下降。综合上述考虑，菜籽蛋白提取条件选为：1g/L NaOH，液料比（V/W）10∶1，温度28℃，提取时间20min，提取次数3次。三次提取过程料液pH分别为：5.97～6.13，7.31～7.54，9.02～9.34，均小于12。

表1 不同条件对菜籽蛋白提取的影响Table 1 Effect of different conditions on extraction of rapeseed protein

经测定，10kg菜籽粕脱毒后，脱毒液中含有848.26g蛋白，而菜籽粕（未提植酸）蛋白含量为38.63%（据表1计算而得），则10kg未脱毒菜籽粕含有3863g蛋白，扣除脱毒损失的848.26g，剩余粕中还有3014.74g蛋白。再根据式（2），则得到蛋白得率Y2的数据，见表1。文中NaOH浓度用g/L代替pH，并采用先配提取剂法，即将配好的提取剂加入到菜籽粕中，均考虑到实际生产中，pH无论是先调还是后调都比较繁琐，特别在pH较高时，pH计反应迟钝，容易影响溶液pH的准确性。因此NaOH浓度用g/L表示，预先调好来提取菜籽蛋白。

2.2 超滤精制菜籽蛋白

表2 加水量对菜籽蛋白纯度的影响Table 2 Effect of water feed on purity of rapeseed protein

按照2.1中选定的蛋白提取条件进行菜籽蛋白放大提取，称取30kg菜籽蛋白提取液进行超滤纯化，通过对超滤过程中加水量的控制，再喷雾干燥截留液，可获得不同纯度的菜籽蛋白产品，加水量对成品菜籽蛋白纯度影响如表2所示。

由表2可看出，加水量增加可显著提高菜籽蛋白的纯度。这是因为菜籽蛋白的提取液含有淀粉、多糖、脂类、醋酸、无机离子等多种非蛋白杂质成分，超滤过程中，由于膜元件上凝胶滤饼层的形成会阻挡一部分非蛋白成分的透过[16]；同时超滤过程中每次截留液浓缩到10～12L时，需要加水才能使超滤继续进行，否则无法超滤，必然导致一部分非蛋白成分还残存在截留液中，影响蛋白纯度的提高。加水增加了料液体积，使得截留液超滤可以继续进行。同时料液的稀释减少了浓差极化的形成[17]，使得非蛋白成分可以更多地透过，从而提升蛋白纯度。但过多的加水量也不经济，会给后续浓缩、干燥造成负担。

2.3 脱毒前后菜籽粕和不同纯度菜籽蛋白的成分分析

由于菜籽粕中含有较多抗营养因子，很大程度上制约了菜籽粕的利用。本研究对脱毒前后菜籽粕和不同纯度的菜籽蛋白进行相关成分分析，见表3。逐一比较每种成分的变化趋势，为相关应用提供依据。

表3 脱毒前后菜籽粕和不同纯度菜籽蛋白的成分分析Table 3 Chemical components analysis of rapeseed meal with pre－and past detoxication and different rapeseed protein on purity

表3反映出不同纯度菜籽蛋白中的抗营养因子含量，相比脱毒前后的菜籽粕均大大减少。特别是植酸和硫苷均未检测出，但多酚依然存在，这也说明多酚很难通过醋酸脱毒和超滤的方法完全去除掉。本文所得到的菜籽蛋白在色泽上明显浅于一般传统碱溶酸沉法制备的蛋白，但与商用大豆分离蛋白还有差距。这是因为菜籽蛋白中多酚的存在，会加深其色泽[18]。

2.4 菜籽蛋白氨基酸分析

以制备的90.49%菜籽蛋白为对象，对其进行氨基酸组成及含量分析，结果见表4。

食物蛋白质营养价值的高低，主要取决于所含必需氨基酸的种类、数量和组成比例。化学评分是目前国际上广泛采用的对蛋白质进行营养价值评价的方法，即对待测样品与标准中的必需氨基酸含量进行比较，比值大于1说明该氨基酸含量高于标准值，是理想状况。从表4分析结果可看出，除色氨酸未检测外，其余七种必需氨基酸均存在。参照两种标准，菜籽蛋白中的甲硫氨酸+半胱氨酸均是第一限制性氨基酸。其余必需氨基酸含量（色氨酸除外）整体均高于FAO/WHO推荐的成人需求标准，却大多低于全蛋蛋白标准。在FAO/WHO标准中，菜籽蛋白的赖氨酸含量充足，而谷物类食品却较低，但谷物类食品富含甲硫氨酸+半胱氨酸[19]，所以可通过二者的配比，达到平衡的氨基酸模式。在全蛋蛋白标准中，虽然菜籽蛋白中一些必需氨基酸含量不足，但可作为鱼的饲料级蛋白，Z.Teskeredžic＇等人曾将幼年虹鳟鱼饲料中39%的蛋白改为由菜籽浓缩蛋白来提供，对鱼的摄食、生长没有任何负面影响[20]。结合表3所示的抗营养因子检测结果，总体评价，菜籽蛋白是一种很具潜力的蛋白补充剂。

表4 菜籽蛋白的氨基酸组成及化学评分CSTable 4 Amino acid composition of rapeseed protein and its chemical score

2.5 菜籽蛋白的功能特性

2.5.1 持水性和吸油性 图1反映出随着蛋白纯度的提高，菜籽蛋白的持水能力和吸油能力均缓慢增强，但持水能力与商用大豆分离蛋白还有一定差距；而商用大豆分离蛋白的吸油性与81.36%菜籽蛋白相当，表明菜籽蛋白具有良好的吸油性。蛋白质持水性是指蛋白质吸收并将水保留在蛋白质组织中的能力，蛋白质的吸油性是指蛋白质与游离脂肪相结合的能力。蛋白的持水性与食品贮藏过程中的“保鲜”及“保型”有密切关系[21]，在食品加工过程中，它会影响食品的机械强度、黏性、塑性以及流动性，并可维持食品中的水分，延长食品的保鲜期。蛋白质良好的吸油性可改善食品的适口性和风味。吸油性和持水性是蛋白质应用于肉类食品生产中的一个重要功能特性，是产品生产加工中的重要质量控制指标。提高蛋白质的持水性和吸油性可有效改善肉类产品的硬度、粘度和口感等。

图1 蛋白持水性和吸油性的比较Fig.1 Comparison of water-holding capacity and fat-absorbing capacity

2.5.2 乳化性及乳化稳定性 由图2可见，乳化性及乳化稳定性均随蛋白纯度提高而上升，90.49%菜籽蛋白乳化性优于商用大豆分离蛋白，但商用大豆分离蛋白乳化稳定性最好。蛋白质的乳化特性在于组成蛋白质的氨基酸既有疏水性氨基酸又有亲水性氨基酸，因此决定了蛋白质分子同时含有亲油性和亲水性基团，是天然的表面活性剂，在油水混合液中可以扩散到油水界面形成油水乳化液[22]。乳状液的形成可给予食品良好的口感，有助于包合油溶性和水溶性的配料，许多食品如牛乳、蛋黄酱、冰激凌、汤料等都是乳状液。

图2 蛋白乳化性及乳化稳定性的比较Fig.2 Comparison of emulsion capacity and emulsion stability

图3 蛋白起泡性比较Fig.3 Comparison of foaming capacity

2.5.3 起泡性及起泡稳定性 从图3和图4可看出，无论起泡性或气泡稳定性，不同纯度的菜籽蛋白总体上都较优于商用大豆分离蛋白，菜籽蛋白随纯度的升高，起泡性不断提高，泡沫稳定性也明显改善。蛋白质的水溶液受到机械搅拌时会有大量气体混入而形成大量的水－空气界面，由于极性和非极性基团的存在，表现出较强的表面活性而吸附到水－空气界面上，形成蛋白质膜，从而降低表面张力，促进泡沫的形成，同时部分肽键在界面上伸展开来，通过分子内和分子间的相互作用力，形成二维保护网络，维持泡沫的稳定。利用蛋白质的发泡性，可以赋予食品疏松的结构和良好的口感，许多加工食品都是泡沫型产品，如奶油、蛋糕、啤酒、果汁软糖等。

图4 蛋白起泡稳定性的比较Fig.4 Comparison of foaming stability

3 结论

3.1 脱毒菜籽粕中的蛋白提取条件为：1g/L NaOH，液料比（V/W）=10∶1，温度28℃，提取时间20min，提取次数3次，此时蛋白提取率为67.97%，相当于能从未脱毒菜籽粕中提取到20.49%的蛋白（占菜籽粕重）。在此条件下得到的蛋白提取液通过控制超滤纯化过程中的加水量，可获得70%～90%不同纯度的菜籽蛋白。

3.2 不同纯度菜籽蛋白中均未检出植酸与硫苷，多酚含量随蛋白纯度增加而显著减少。氨基酸分析表明：除色氨酸未检测外，其余七种必需氨基酸均存在。甲硫氨酸+半胱氨酸是菜籽蛋白中的第一限制性氨基酸，其余必需氨基酸化学评分均高于FAO/WHO标准，却大多低于全蛋蛋白标准。

3.3 菜籽蛋白的持水性、吸油性、乳化性及乳化稳定性、起泡性及泡沫稳定性均与蛋白纯度呈正相关，90.49%蛋白的各项功能特性最好。与商用大豆分离蛋白相比，菜籽蛋白持水性、乳化性及乳化稳定性还有差距，吸油性整体差别不大，而起泡性与泡沫稳定性则明显优越。

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Study on preparation of high-purity rapeseed protein and its properties

ZHOU Jun，PAN Li-jun，HAN Zhi-hong
（School of Biotechnology and Food Engineering，The Key Laboratory for Agricultural Products Processing of Anhui Province，Hefei University of Technology，Hefei 230009，China）

Protein was extracted from coldpressed rapeseed meal which was detoxicated firstly，then the extract was ultrafiltered to obtain high-purity rapeseed protein，chemical components，amino acid and function of proteins were also studied.Extraction rate of protein from rapeseed meal after detoxication was 67.97%，rapeseed protein of different purity from 70%to 90%could be prepared by ultrafiltration.Phytic acid，glucosinolate were not detected in proteins，and content of polyphenol was decreased obviously with rise of protein purity.Sulphur-containing amino acid（Methionine+Cysteine）was the first limiting amino acid.Chemical scores of the other essential amino acids were higher than FAO/WHO standard，but most were inferior to standard of whole egg protein.Capacities of water-holding，fat-absorbing，emulsion，emulsion stability，foaming and foam stability correlated positively with purity of rapeseed protein.

high-purity rapeseed protein；preparation；property

TS201.2+1

B

1002－0306（2012）03－0189－05

2011－04－08

周俊（1986－），男，硕士研究生，研究方向：食品现代加工理论、方法及工程化技术。

国家“863”计划项目（2010AA101503）；“十一五”国家科技支撑计划项目（2006BAD05A12）。