朱 松，娄在祥，陈尚卫，戴 军，王洪新，*

（1.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122；2.江南大学食品学院，江苏无锡214122）

超声辅助酶法提取废次烟叶中绿原酸、烟碱工艺研究

朱 松1，娄在祥2，陈尚卫1，戴 军1，王洪新2，*

（1.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122；2.江南大学食品学院，江苏无锡214122）

将超声波技术与酶法相结合提取烟叶中的绿原酸和烟碱。通过实验得出最适宜的酶为纤维素酶；在单因素实验的基础上，通过正交实验优化超声波辅助酶法同时提取绿原酸和烟碱的最佳条件为：酶用量1%（以烟叶质量计）、酶解时间1.5h，酶解温度50℃。在最佳条件下，绿原酸的提取率为91.5%，烟碱的提取率为92.2%，与其他提取方法比较，超声波辅助酶法对烟叶中绿原酸、烟碱的提取具有明显的促进作用。

烟叶，绿原酸，烟碱，超声波，酶，提取

我国是烟草种植大国，每年都有大量的低次烟叶亟待处理与利用，否则将造成环境污染和资源浪费[1]。绿原酸是烟草中含量最多、最重要的多酚类化合物之一，它是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物[1-3]，具有抗菌、抗病毒、利胆、增高白血球等多种药理作用[4-6]，是保健品、食品、药品、化妆品等工业的重要原料。烟碱是天然烟草中最主要的生物碱，是重要的化工和医药原料；高纯度的烟碱可用作戒烟膏、治疗关节痛类药物的原料，烟碱在生态农业发展中也应用广泛[7-10]。随着近年来医药、农业、化工等诸多领域的迅速发展，市场上对天然烟碱、绿原酸的需要量与日俱增，因此从废弃烟草中提取烟碱、绿原酸具有很高的经济价值，不仅可以变废为宝，而且可以提高烟草的附加值，实现烟草的综合利用。超声波辅助提取可以显著加速传质过程，提高提取效率，并且容易实现工业化应用[11]。与传统的提取方式比较，具有明显优势[12]；同时，酶法提取可以迅速破坏细胞壁结构，显著改善提取效果[13-14]。然而，采用超声波辅助酶法提取烟叶中活性成分的研究未见报道。本文以烟叶为原料，利用超声波辅助酶法提取绿原酸与烟碱，并对其提取条件进行了优化。为烟叶有效成分的提取探索一种新的途径，为废次烟叶的综合利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

烤烟C1F 2009年安徽蚌埠产；绿原酸、烟碱标准品（纯度≥98%） 美国Sigma公司；甲醇（色谱纯） 美国天地公司；中性蛋白酶（酶活22000U/mL），纤维素酶（酶活20000U/mL），果胶酶（酶活30000U/mL），淀粉酶（酶活30000U/mL） 均为诺维信公司。

BC-R202B型旋转蒸发仪 上海贝凯生物化工设备有限公司；HH-4S数显恒温水浴锅 金坛市富华仪器有限公司；EL204-I电子天平、FE20K酸度计 梅特勒-托利多仪器公司；GZX-GF101-2BS电热恒温鼓风干燥箱 上海跃进医疗器械厂；Agilent1100高效液相色谱仪 美国Agilent公司。

1.2 实验方法

1.2.1 废次烟叶中绿原酸、烟碱酶法提取的单因素实验 以粉碎后的干燥废次烟叶为原料，加入1∶10（料液比，w/w）的水，再加入酶，恒温酶解。酶处理后的烟叶在超声波作用下提取30min。分别考察酶种类、酶用量、酶解时间、提取温度等对烟草中绿原酸、烟碱提取率的影响。

1.2.2 超声辅助酶法提取的显著性作用实验 在相同条件下，比较酶法处理提取和超声辅助酶法提取对烟草中绿原酸、烟碱提取率的影响。

1.2.3 超声辅助酶法提取废次烟叶中绿原酸、烟碱条件的优化 在单因素实验结果的基础上，通过选取酶用量、酶解时间、温度为考察因素指标，按L9（34）正交表对酶解法提取工艺进行研究，确定废次烟叶中绿原酸、烟碱酶法提取的最佳工艺参数。

1.2.4 分析方法 绿原酸采用高效液相色谱法定量分析[15]：色谱条件为：色谱柱HypersilBD-C18（250mm× 4.6mm i.d）；流动相25%乙腈＋0.5%乙酸；流速1mL/min；进样温度30℃；进样量10μL；检测波长280nm。烟碱测定：色谱条件为：Alitima-C18（150mm×4.6mm i.d）；甲醇-磷酸盐缓冲液（8∶2）；检测波长262nm；流速1mL/min；柱温25℃。

2 结果与分析

2.1 酶种类对提取效果的影响

取60目的烟叶粉末5.00g，按1∶10的料水比加50mL水，添加1%的中性蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、果胶酶，在酶解温度为50℃下酶解60min，升温至85℃灭酶，冷却，HPLC法测定绿原酸和烟碱含量，计算提取率。结果见图1，经纤维素酶处理后得到的绿原酸、烟碱的提取率为最大，故选择纤维素酶作为提取烟叶有效成分的最适酶制剂。

图1 酶种类对烟叶中绿原酸、烟碱提取的影响Fig.1 The effect of various enzymes on the extraction of chlorogenic acid and nicotin from tobacco leaves

2.2 酶用量对提取效果的影响

从图2可以看出，绿原酸的提取率随酶用量的增加不断升高，当酶用量到1.25%时，酶量再增加，绿原酸的提取率没有明显变化。这可能是由于当酶用量低于最佳值时，酶解进行得不完全，绿原酸释放出的量较少，提取率低，当达到最佳值时，酶解反应则较彻底，此时如再继续增加酶用量，酶解反应进行的程度不会有太大的变化，反而会增加酶的浪费。对烟碱来说，与绿原酸提取率呈相同趋势，酶用量的增加，烟碱提取率有升高趋势，当酶用量达到1%时，随着酶量的增加，烟碱提取率没有明显增加。

图2 酶用量对提取物的影响Fig.2 The effect of amount of enzyme on the extraction of chlorogenic acid and nicotin

2.3 酶解时间对提取效果的影响

图3 酶解时间对提取物的影响Fig.3 The effect of extraction time on the yields of chlorogenic acid and nicotin

从图3可以看出，绿原酸的提取率随酶解时间的增加不断升高。酶解时间为1h时，绿原酸提取率达到最大值，接着随着酶解时间的延长而趋于平缓，绿原酸提取率没有明显变化。这可能是由于随着时间的延长，酶活力可以得到充分发挥，酶解反应进行得较完全，提取液中绿原酸含量便不再明显增加。对烟碱来说，与绿原酸提取率呈相同趋势，但是当酶解时间为1.5h时，提取率随温度的增加增势变缓。故酶解时间选择在1h。

2.4 酶解温度对提取效果的影响

图4 酶解温度对提取物的影响Fig.4 The effect of extraction temperature on the yields of chlorogenic acid and nicotin

从图4可以看出，绿原酸的提取率随酶解温度升高而增加，当温度为55℃时，到达峰值，酶解温度继续升高，绿原酸的提取率开始减少。原因一：由于酶解温度的增加，绿原酸的邻苯二酚结构不稳定，高温加热易氧化分解；原因二：随着温度的升高，底物分子的热能增加，酶解反应的速率增加，绿原酸提取率增大，但当温度继续升高，导致酶活性降低，酶解反应受抑制，因此温度过高提取液中绿原酸含量便不再明显增加，甚至有降低的趋势。对烟碱来说，随温度的升高，提取率呈增加趋势，但是当温度达到55℃后，提取率随温度的增加增势趋缓。因此，酶解温度选择在55℃。

2.5 超声作用对酶法提取率的显著性影响

超声波对烟叶中有效成分提取的影响见表1。由结果可以看出，超声波作用对烟草中有效成分的提取率有显著影响，经过超声波辅助作用后，绿原酸的平均提取率从87.2%提高到91.5%，烟碱的平均提取率的增长更为明显，从86.7%提高到92.2%。这主要是由于经过超声波作用后，烟叶的细胞结构被进一步破坏，从而有效改善了绿原酸和烟碱的提取效果。

表1 超声波处理对绿原酸、烟碱提取的影响Table 1 The effect of ultrasonic treatment on the yields of chlorogenic acid and nicotin

2.6 正交实验优化提取工艺

在单因素实验的基础上，采用L9（34）正交实验（见表2），考察酶用量（%）、酶解时间（h）与酶解温度（℃）对绿原酸和烟碱提取率的交叉影响。因素水平表和正交实验结果见表2和表3。

表2 因素水平表Table 2 Factors and levels

表3 正交实验方案及结果Table 3 The results of orthogonal test

表4 正交实验极差分析Table 4 Analysis of the results of orthogonal test

由表4可知，各因素对绿原酸的影响主次顺序为A＞B＞C，最优提取方案为A3B3C2，即酶解法提取绿原酸的最佳工艺条件是：酶液量1%，在55℃水浴中处理1.5h；而对于烟碱，各因素主次顺序为A＞B＞C，最优提取方案为A3B3C1，即酶解法提取烟碱的最佳工艺条件是：酶液量1%，在45℃水浴中处理1.5h。综合考虑，同时提取绿原酸、烟碱工艺为酶用量1%（以烟叶质量计）、酶解时间1.5h，酶解温度50℃。

3 结论

超声波辅助提取作为一种有效提取方法，因其简单、方便、快速等优点，在植物的有效成分提取中得到广泛的应用；纤维素酶可在温和的条件下将植物组织分解，加速有效成分的释放，且不破坏其生物活性。将超声波和纤维素酶结合起来应用于植物活性成分的提取，能强化对植物细胞壁的破坏而更好地促进胞内成分的释放、扩散和被提取。

本实验通过正交实验优化了超声辅助酶法提取废次烟叶中绿原酸、烟碱的工艺，得出了烟叶中绿原酸、烟碱同时提取的最佳工艺条件为：酶用量1%（以烟叶质量计）、酶解时间1.5h、酶解温度50℃。在最佳条件下，绿原酸的提取率为91.5%，烟碱的提取率为92.2%，与其他提取方法比较，超声波辅助酶法对烟叶中绿原酸、烟碱的提取具有明显的促进作用。

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Study on ultrasound-assisted enzyme extraction of chlorogenic acid and nicotin from tobacco leaves

ZHU Song1，LOU Zai-xiang2，CHEN Shang-wei1，DAI Jun1，WANG Hong-xin2，*
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Food Science＆Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Ultrasonic technique and enzyme were employed to extract chlorogenic acid and nicotin from tobacco leaves.The results indicated that ultrasonic technique and enzyme treatment significantly promoted the extraction of chlorogenic acid and nicotin.The optimum condition of extraction was obtained through orthogonal test.Experiment results showed that the optimum extraction parameters were：1.0%dry weight of amylase，extraction time of 1.5h，temperature of 50℃.Under this condition the extraction rate of chlorogenic acid was up to 91.5%，and nicotin was 92.2%.

tobacco leaves；chlorogenic acid；nicotin；ultrasonic technique；enzyme；extraction

TS49

B

1002-0306（2012）05-0181-04

2011－05－25 *通讯联系人

朱松（1979-），男，工程师，研究方向：天然资源开发利用。