王章存，陆 杰，2，李乐静，崔胜文

（1.郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州450002；2.江苏省泰州市产品质量监督检验所，江苏泰州225300）

谷朊粉的有限酶解对其分散性及胶黏性的影响

王章存1，陆 杰1，2，李乐静1，崔胜文1

（1.郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州450002；2.江苏省泰州市产品质量监督检验所，江苏泰州225300）

为了改善谷朊粉在水溶液中的物化性能，利用碱性蛋白酶对谷朊粉进行了有限水解。通过单因素实验，分析了底物浓度、反应温度、加酶量和反应时间对其分散稳定性、胶黏性的影响，并分析了酶解物中的蛋白质分子粒径。通过正交实验确定了以提高谷朊粉分散特性和胶黏性为目的的最佳酶解条件为：底物浓度0.30g/mL、温度50℃、加酶量0.50%、反应时间20min，此时可使谷朊粉的相对分散稳定性达到96.3%，黏度为3.2mPa·s，蛋白质平均分子粒径604.6nm。分析显示，不同酶解样品分散稳定性、黏度和蛋白质平均分子粒径三种指标之间的变化趋势并不完全一致。

谷朊粉，有限酶解，分散稳定性，胶黏性，蛋白质粒径

谷朊粉是小麦淀粉生产的一种副产品，主要由麦谷蛋白以及麦醇溶蛋白组成，具有优良的黏弹性、薄膜成型性、吸脂乳化性等，对小麦面粉食品的加工品质有重要的影响[1-3]。但是，谷朊粉中的蛋白质都是大分子，且含有较多的疏水性氨基酸[4]，在水中的溶解性和分散性很差，无法与溶液中的其他成分形成均匀的体系，限制了它作为食品配料在食品工业尤其是流体食品加工中的应用范围。因此，谷朊粉的改性已成为小麦蛋白深加工研究的一个热点，其中，酶法改性应用最为广泛，通过酶解作用将大分子的谷朊粉蛋白质降解，提高其在水中的溶解性、乳化性和起泡性等功能性[5-7]。但是，目前文献中对谷朊粉酶解物的溶解性、乳化性和起泡性等功能性质的分析往往局限于酶解后离心处理得到的可溶性部分[8-11]。这些研究有诸多弊端，一是产物的得率（即酶解可溶性部分与原料的比率）低，影响在实际生产中的应用；二是可溶部分大多是小分子蛋白质和小肽，影响其乳化性、起泡性、黏弹性等，因为大分子蛋白质才具有这样的功能性质。目前文献对谷朊粉流变学的分析主要是谷朊粉加入少量水后在固体或半固体状态下的结果，在水溶液中谷朊粉只在局部聚集形成面筋团[12-15]。实际上，谷朊粉经过有限酶解后只要在水中有较好的分散性即可大大拓展它的用途，如用于豆腐、火腿肠等凝胶型和蛋白饮料等液体型食品的开发，也可用于可降解性食品包装材料蛋白膜中。因此，本实验根据谷朊粉的实际应用特点，首次提出以酶解产物的分散特性为主要评价指标、兼顾其胶黏性、分子粒径等指标，研究碱性蛋白酶有限酶解对谷朊粉上述指标的影响，以期既改善谷朊粉在食品加工中的功能性质，又能大大提高谷朊粉酶解物的产品得率（注：本实验谷朊粉酶解后不离心直接用于性能分析，故产品得率为100%）。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

谷朊粉 蛋白质含量80.6%（W/W），郑州新威营养科技有限公司；碱性蛋白酶（Alcalase 2.4L） 诺维信公司；氢氧化钠（分析纯） 天津市光复科技发展有限公司；盐酸（分析纯） 开封市芳晶化学试剂有限公司。

868型酸度计 上海热电仪器有限公司；78-1型磁力加热搅拌器 江苏金坛正基仪器有限公司；FA1004电子天平 上海上平仪器有限公司；TDA型电子恒温水浴锅 北京永光明医疗仪器厂；NDJ-7型旋转式粘度计 上海安德仪器设备有限公司；UV-2100型紫外可见光分光光度计 上海尤尼科仪器有限公司；Zeta-Plus激光粒度仪 美国BrookHaven公司。

1.2 实验方法

1.2.1 谷朊粉酶解物的制备 在酶反应器中，将蒸馏水加热至设定的温度，搅拌条件下，将谷朊粉加入其中，制成一定浓度的蛋白质悬浮液，调节设定pH后，恒温搅拌，使谷朊粉充分溶胀，将蛋白酶按一定比例加入悬浮液中（各单因素实验时的具体酶解条件见结果与分析部分），开始计时，振荡并保持恒温，酶解过程中不断用氢氧化钠（1.0mol/L）滴定维持溶液pH恒定。水解结束后，调节pH至中性，于沸水浴中加热10min使酶失活，冷却，即得谷朊粉酶解物。

1.2.2 酶解物分散性测定 取一定量的酶解物，稀释至体积为100mL、浓度1.0mg/mL后，于分光光度计中280nm处测定其吸光值（A），记录10min内吸光值的变化。最大值（Amax）、最小值（Amin）的相对大小可以反映酶解物中蛋白质分子沉降情况，即分散特性，二者的比值则反映酶解物的分散稳定性。实验重复3次，取平均值。酶解物初始吸光度值即为最大值，随着蛋白分子沉降，吸光度值会有所降低，沉降越慢，吸光度值降低越少，分散越稳定。所以，根据以上蛋白沉降与光吸收值关系可将酶解物分散稳定性定义为：

1.2.3 酶解物黏度测定 将不同酶解条件下的样品用水稀释至体积为200mL浓度均为0.1g/mL后，采用旋转粘度计测定溶液的黏度（η），每组样品重复测定3次，取其平均值。

1.2.4 酶解物蛋白质分子粒径测定[16]取一定量不同酶解条件下的酶解物样品，稀释至体积为100mL、浓度为0.50mg/mL后，于Zeta-Plus激光粒度仪中测定其粒径大小分布和比例，以平均粒径表示酶解物蛋白分子粒径大小。平均粒径=∑（粒径大小×该粒径所占比例）/∑粒径所占比例。

1.3 数据处理

实验数据用SPSS软件处理。

2 结果与分析

2.1 谷朊粉浓度对酶解物性质的影响

分别配制不同底物浓度0.10～0.30g/mL的谷朊粉悬浮液500mL进行酶解，酶解温度50℃，加酶量E/S为0.50%，pH8.5，酶解时间10min。反应结束后，分别取样稀释至规定浓度后，测定不同样品的分散性和分散稳定性、黏度及蛋白质分子粒径，结果如图1所示。

图1 底物浓度对酶解物性能和分子粒径的影响Fig.1 Effect of gluten concentration on disperse stationarity，viscosity and average size of hydrolysates

研究发现，在不同底物浓度下酶解产物的分散性差别不大，但随着底物浓度的增加，谷朊粉酶解物的分散稳定性及黏度都有所提高，当底物浓度超过0.25g/mL后，上述指标增加幅度有所减缓，底物浓度达0.30g/mL时上述指标增长趋于平缓（图1a）。这可能与谷朊粉酶解时蛋白质分子的变化有关。谷朊粉经过适当酶解后，蛋白质大分子变为相对较小的分子，在水中的分散性增加，同时也表现出一定的黏性。低浓度酶解物的分散稳定性较低，可能与其分子不均一性有关；而在较高底物浓度水解时，蛋白质分子被降解的程度较低且分子大小较为均匀，蛋白质分子之间更容易粘连，溶液胶黏性和分散稳定性较高。用激光粒度仪测定结果也表明，高浓度酶解后蛋白质分子的平均粒径大于低浓度时的平均粒径（图1b），且低浓度酶解的产物中分子大小离散度较大。因此，确定最适的底物浓度为0.30g/mL。

2.2 酶解时间对酶解物性质的影响

配制谷朊粉浓度0.30g/mL溶液500mL，酶解温度50℃，加酶量为0.50%和pH8.5时，测定不同酶解时间（10、20、30、40、50min）后的酶解物的分散特性、黏度及蛋白质分子粒径。结果表明，随着酶解时间的增加，谷朊粉酶解物的分散稳定性呈上升趋势，而黏度呈下降趋势（图2a）。这可能是酶解时间越长，蛋白分子越小，在水中分散性较好，呈溶解状态而不容易沉淀。但是，小蛋白分子之间不易胶粘，溶液黏度会大大下降。从粒径分析的结果（图2b）也可以看出，随着酶解时间延长，酶解物中蛋白分子的平均粒径也不断下降。虽然随着酶解时间的延长，分散性会略有提高，但相差并不是很大，而胶黏性却下降很多，不利于谷朊粉酶解产物的进一步应用。因此，确定最适的酶解时间为10min。

图2 酶解时间对酶解物性能和分子粒径的影响Fig.2 Effect of enzymolysis time on disperse stationarity，viscosity and average size of hydrolysates

2.3 加酶量对酶解物性质的影响

配制500mL谷朊粉浓度为0.30g/mL溶液，在酶解温度50℃，pH8.5和酶解时间10min条件下，考察不同加酶量水解对谷朊粉分散特性、黏度及其蛋白质分子粒径的影响，结果如图3所示。可以看出，随着加酶量的提高，谷朊粉酶解物的分散稳定性略有提高，而黏度却不断下降。可能是增加酶用量使得蛋白水解得更为充分，蛋白颗粒变小，粒径分析的结果（图3b）也证明了这一点。另外，增加酶用量还会干扰酶解液的组成且大大增加成本，而加酶量小于0.50%时谷朊粉蛋白质分子几乎无法在水中分散，也无法测定其黏度，因此，确定最适的加酶量为0.50%。

2.4 酶解温度对酶解物性质的影响

配制500mL谷朊粉浓度为0.30g/mL溶液，在加酶量为0.50%，pH8.5和酶解时间10min条件下，测定不同的酶解温度下样品的分散特性、黏度及蛋白质分子粒径。结果表明，温度在40～50℃之间时，随着温度的升高，酶解物的分散稳定性及黏度呈上升趋势；温度高于50℃时，随着温度的升高，酶解物的分散稳定性几乎不变，而黏度呈下降趋势（图4）。这可能是温度低于50℃时，酶的活性较低，蛋白不能充分酶解，无法在水中很好地分散形成稳定悬浮液；温度高于50℃时，随着温度的升高酶的活性有所提高，但蛋白质分子只是略微变小，所以酶解物分散稳定性几乎不变，而黏度略微下降。粒径分析结果与此分析也相吻合（图4b）。此外，温度高于60℃时，碱性酶会因温度过高而逐渐失活，同时还会引起蛋白结团，不易形成稳定的分散悬浮液，也不利于酶解反应。因此，确定最适的酶解温度为50℃。

图3 加酶量对酶解物性能和分子粒径的影响Fig.3 Effect of enzyme concentration on disperse stationarity，viscosity and average size of hydrolysates

图4 酶解温度对酶解物性能和分子粒径的影响Fig.4 Effect of the temperature on disperse stationarity，viscosity and average size of hydrolysates

2.5 碱性蛋白酶水解谷朊粉条件优化

根据单因素实验可知，在碱性蛋白酶水解谷朊粉的反应中，影响因素主要有时间、温度、加酶量以及底物浓度，为了得到分散性能较好、黏度较高的酶解物，在上述单因素实验的基础上，采用L9（34）正交实验对碱性蛋白酶水解谷朊粉的条件进行优化，反应液体积为500mL。实验结果如表1所示。

表1 正交实验方案及结果Table 1 Results of orthogonal test for enzymolysis of wheat gluten

由极差分析可以看出，4个因素对谷朊粉分散性影响的主次顺序为：Dgt;Bgt;Cgt;A，即底物浓度gt;反应温度gt;加酶量gt;反应时间，最优组合为A3B2C1D3，与正交表中的第8组实验一致，此最佳条件下谷朊粉分散性为98.5%，黏度为2.8mPa·s。4个因素对谷朊粉胶黏性影响的主次顺序为：Dgt;Cgt;Agt;B，最优组合为A1B2C1D3，这个组合并未出现在正交表中，按此优化条件安排实验，结果为谷朊粉分散性为92.6%，黏度为3.4mPa·s。可以看出，两组的最佳温度（50℃）、加酶量（0.50%）及底物浓度（0.30g/mL）都相同，只是酶解时间有所区别。酶解时间较长，酶解物分散性较好，但蛋白颗粒较小，黏度会大大下降，并不利于谷朊粉进一步在生产中的应用，缩短酶解时间可提高谷朊粉黏度，同时对其分散性影响并不大，仍能维持在90%以上。因此，综合考虑对谷朊粉分散性及黏度的影响，确定最佳酶解条件为A2B2C1D3，即时间20min，温度50℃，加酶量0.50%，底物浓度0.30g/mL。此时谷朊粉分散性为96.3%，粘度为3.2mPa·s，均达到较高水平，蛋白质分子平均粒径也达到了604.6nm，高于正交实验中各组实验的结果，证明分析所得的最佳酶解条件是可靠的。

为了进一步考察不同酶解样品的分散稳定性、黏度和分子粒径之间的关系，将其三种指标的分析结果列于图5。可以看出，样品中蛋白质平均分子粒径和黏度并不是随着分散稳定性的增大而持续增加；平均分子粒径与黏度的变化趋势虽然相似，但在具有不同分散稳定性样品中，二者的变化幅度并不相同，说明酶解物的分散稳定性和黏度需要不同的蛋白质分子特征。

图5 谷朊粉酶解物分散稳定性、黏度和分子粒径之间的相关性Fig.5 Relationship between disperse stationarity，viscosity and average size of the hydrolysates

3 结论

3.1 本实验首次研究了以改善谷朊粉的分散性能和胶黏性为目的的酶解条件，在单因素分析的基础上，采用正交实验优化的结果为：底物浓度0.30g/mL，温度50℃，加酶量0.50%，反应时间20min，在此条件下得出的谷朊粉酶解物分散稳定性为96.3%，黏度达到了3.2mPa·s，得到了较满意的效果。

3.2 对谷朊粉酶解物粒径分布及分散性能、胶黏性能关系的分析表明，蛋白质平均分子粒径和黏度并不是随着分散稳定性的增大而持续增加，三种指标之间的变化程度并不完全一致。

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Effect of limited enzymatic hydrolysis on dispersity and viscosity of wheat gluten

WANG Zhang-cun1，LU Jie1，2，LI Le-jing1，CUI Sheng-wen1
（1.School of Food＆Bioengineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450002，China；2.Product Quality Supervising and Inspecting Institute of Taizhou City，Taizhou 225300，China）

Wheat gluten was limited hydrolyzed by Alcalase to improve its physical and chemical properties.The effects of hydrolysis conditions such as gluten concentration，reaction temperature，enzyme-gluten ratio and reaction time on the dispersity stationarity and viscosity of wheat gluten hydrolysates were researched first with the single factor experiment.The protein molecular partical size of the hydrolysates was also determined.And then，the optimized condition of the proteolysis was carried out by orthogonal experiment as the following：gluten concentration was 0.30g/mL，temperature was 50℃，enzyme-substrate ratio was 0.50%and hydrolysis time was 20min.According to the condition，the dispersity stationarity of the hydrolysates achieved 96.3%，viscosity was 3.2mPa·s，protein molecular size was 604.6nm.The variation trend of dispersity stationarity，viscosity and the molecular size of the hydrolysates were not synchronization.

wheat gluten；limited enzymolysis；dispersity stationarity；viscosity；protein partical size

TS239

A

1002-0306（2012）05-0119-05

2010－12－28

王章存（1963－），男，教授，博士，主要从事粮油植物蛋白和食品生物技术研究。

郑州轻工业学院博士基金项目（2007BJ0016）。