王 伟，张艳华，李超华，王立升，*，唐江涛，*

（1.广西大学化学化工学院，广西南宁530004；2.广西花红药业股份有限公司，广西柳州545005）

一点红提取物体外抗氧化活性研究

王 伟1，张艳华2，李超华2，王立升1，*，唐江涛1，*

（1.广西大学化学化工学院，广西南宁530004；2.广西花红药业股份有限公司，广西柳州545005）

目的：研究一点红提取物体外抗氧化活性。方法：通过水提醇沉、有机溶剂萃取、大孔树脂吸附纯化，得到六种不同部位的样品。以抗坏血酸和2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚为对照，测定样品对羟基自由基和二苯基苦基苯肼自由基的清除能力，对Fe3+的还原能力，抑制油脂的氧化能力。结论：上述样品均具有一定的抗氧化活性，其中大孔树脂纯化的50%乙醇洗脱部位活性最好，但总体上弱于抗坏血酸和2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚。

一点红，抗氧化活性，大孔树脂，二苯基苦基苯肼，羟基自由基，还原能力

一点红[Emilia sonchifolia（Linn.）DC]是菊科一点红属一年生或多年生草本植物，是我国南方地区经常使用的传统中草药，又名羊蹄草、乳汁草、叶下红、野苦草等。一点红性味苦、凉，功能主治清热解毒、散瘀消肿，可用于上呼吸道感染、肺炎、乳腺炎、肠炎、外伤感染、急性结膜炎、急性扁桃体炎、胆囊炎、传染性肝炎、菌痢、尿路感染、湿疹、跌打损伤等[1]。研究表明，一点红富含生物碱、黄酮类、三萜类、酚类等化学物质，特别是黄酮类物质可能与一点红抗菌消炎功能有关[2-4]。本研究对一点红进行提取分离，并首次追踪其抗氧化活性部位，为找到一点红抗氧化作用的活性成分建立基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

一点红（干燥全草） 广西花红药业股份有限公司；二苯基苦基苯肼（DPPH）、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT） Sigma公司；石油醚、乙酸乙酯、无水乙醇、正丁醇、水杨酸、氢氧化钠、双氧水、硫代硫酸钠、盐酸、硫酸和碳酸钠、硫酸亚铁铵、抗坏血酸（VC）等 均为分析纯；D101树脂 沧州宝恩化工有限公司。

UV-T6型紫外-可见分光光度计 北京普析通用有限公司；RE-2000型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；SHB-Ⅲ循环式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司；真空干燥箱 上海博讯实业有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 一点红的提取分离

1.2.1.1 样品Ⅰ的制备 采用水提醇沉法[5]。在10L圆底烧瓶中放入500g一点红，加入约5000mL水，加热回流2h，抽滤，保存滤液；再加入约4000mL水于圆底烧瓶中，回流2h，抽滤，合并滤液，浓缩，得黑色浸膏。在黑色浸膏中加入一定量65%乙醇溶液，超声溶解，置于冰箱中过夜，第2d进行抽滤，浓缩，得到浸膏。将浸膏分成浸膏Ⅰ和浸膏Ⅱ，取浸膏Ⅰ，减压浓缩，65℃下真空干燥，得水提醇沉部位，即样品Ⅰ。

1.2.1.2 样品Ⅱ的制备 将1.2.1.1中浸膏Ⅰ加入去离子水溶解，用石油醚脱脂数次，分取水层，用乙酸乙酯萃取至乙酸乙酯层为无色。对乙酸乙酯层减压浓缩，65℃真空干燥，得乙酸乙酯提取部位，即样品Ⅱ。

1.2.1.3 样品Ⅲ的制备 取1.2.1.2中乙酸乙酯萃取后的水层，加入水饱和的正丁醇萃取，至正丁醇层为无色。对正丁醇层减压浓缩，65℃真空干燥，得正丁醇提取部位，将所得正丁醇提取部位分为两份，其中的一份即为样品Ⅲ。

1.2.1.4 样品Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ的制备 取1.2.1.3中一份正丁醇醇提取部位，用适量的去离子水溶解，选用D101大孔树脂过柱。将上述水溶物过预先处理好的大孔树脂柱进行吸附分离，依次用去离子水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇和无水乙醇进行洗脱，每次洗脱至洗脱液接近无色，分别收集洗脱液，减压回收溶剂。由于70%乙醇、90%乙醇和无水乙醇洗脱得到量很少，因此取去离子水、30%乙醇和50%乙醇洗脱液减压回收溶剂，置于真空干燥箱中65℃下干燥，得去离子水洗脱部位、30%乙醇洗脱部位和50%乙醇洗脱部位，即为样品Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ。

1.2.2 体外抗氧化活性研究

1.2.2.1 样品溶液与阳性参照溶液的配制 样品溶液配制：精确称取各样品0.1g，用60%乙醇溶解并定容于100mL容量瓶中，得1mg/mL的样品溶液，置于冰箱避光保存备用。抗坏血酸溶液配制：精确称取0.1g抗坏血酸，用60%乙醇溶解并定容于100mL容量瓶中，得1mg/mL的阳性对照溶液，置于冰箱避光保存备用。BHT溶液配制：精确称取10mg BHT，用60%乙醇溶解并定容于100mL容量瓶中，得1mg/mL的样品溶液，置于冰箱避光保存备用。

1.2.2.2 对DPPH自由基清除能力的测定[6]DPPH溶液的配制：精确称取10mg DPPH，用无水乙醇溶解并定容于250mL的容量瓶中，得样品溶液。对照品测定：吸取1mL 60%乙醇溶液和8mL DPPH溶液置于试管中，摇匀混合，避光放置，每隔10min于517nm波长下测定其吸光度Ac。样品测定：分别吸取1mL样品溶液和8mL DPPH溶液置于试管中，摇匀混合，避光放置，每隔10min于517nm波长下测定其吸光度Ai。

式中：Ac为1mL60%的乙醇加8mL DPPH溶液的吸光度；Ai为1mL各样品溶液加8mL DPPH溶液的吸光度。清除率越高，样品抗氧化能力越强。

同法以1mg/mL的抗坏血酸溶液和0.1mg/mL的BHT溶液进行DPPH自由基清除能力的测定。所有测定重复三次，取其平均值。

1.2.2.3 对羟基自由基清除能力的测定[7]利用Fenton反应H2O2和Fe2+混合产生·OH，在此体系内加入水杨酸，可以捕捉·OH并产生有色物质，该物质在510nm波长下有最大吸收峰。依次在每个25mL容量瓶中加入2mL各样品溶液，2mL 9mmol/L FeSO4，2mL 9mmol/L水杨酸-乙醇溶液，最后加入0.03%的H2O2溶液启动反应。在37℃水浴条件下反应0.5h，以去离子水为对照，用60%乙醇定容，然后在510nm波长下测定各待测液的吸光度。考虑到样品溶液本身在510nm波长下也有吸光值，因此，以2mL各样品溶液，2mL 9mmol/L FeSO4，2mL 9mmol/L水杨酸-乙醇溶液为本底吸收，测量吸光值时定容。

式中：A0为空白对照液的吸光度；Ax为加入样品溶液后的吸光度；Ax0为不加H2O2溶液本底的吸光度。

同法以1mg/mL的抗坏血酸溶液进行·OH自由基清除能力的测定。所有测定重复三次，取其平均值。

1.2.2.4 Fe3+还原能力的测定[8]取若干试管，移取1mL各样品溶液，分别加入2.50mL pH6.6 0.2mol/L磷酸缓冲液和2.50mL 1%的K3Fe（CN）6溶液，摇匀混合。于50℃水浴条件下反应20min后，快速冷却后加入2.50mL 10%的三氯乙酸溶液，摇匀后置于离心机中，以3000r/min离心10min，取上清液2.50mL，加入2.50mL去离子水和0.50mL 0.1%的FeCl3溶液，于700nm波长下测定吸光度值，吸光度越大，其还原能力就越强。所有测定重复三次，取其平均值。

1.2.2.5 对油脂氧化抑制作用的测定[9]精确称取花生油8份，每份40g，置于250mL的烧杯中，分别移取10mL样品溶液至不同烧杯中，不时搅拌成均相，置70℃恒温干燥烘箱中，每隔24h取2.0g油样移至锥形瓶中，测定油脂过氧化值（POV）。每次取样后充分振摇烧杯，以混入足够的空气。POV测定方法参照GB/ T5538-1995的方法。

称取2.0g试样，加入到250mL锥形瓶中。在装有试样的锥形瓶中加入25mL氯仿-乙酸溶液（2∶3，v∶v）溶解试样，并立即加入1mL碘化钾饱和溶液，迅速盖好瓶塞，混匀溶液1min，在25℃避光静置5min。加入约75mL蒸馏水，以0.5%淀粉溶液作为指示剂，用硫代硫酸钠标准溶液滴定析出的碘。滴定过程要用力振摇，滴定到蓝色消失为止，记下体积V1，计算POV。POV计算公式为：

式中：POV为样品过氧化值（meq/kg）；C为硫代硫酸钠标准溶液的摩尔浓度（mol/L）；V1为样品消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积（mL）；V2为空白实验消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积（mL）；M为试样质量（g）；0.1269为与1mL Na2S2O3标准滴定溶液相当的碘的质量（g）。

2 结果与分析

2.1 各样品对DPPH自由基的清除作用

按1.2.2.2所述方法，得不同时间下，各样品和BHT对DPPH自由基的清除作用，如图1所示。

从图1可知，一点红提取部位样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、大孔树脂分离部位Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和BHT对DPPH自由基均具有清除作用。随着反应时间的增长，对DPPH自由基的清除率都增大。由图1可以看出，样品Ⅲ、Ⅳ和V对DPPH·的清除率都小于30%，而样品Ⅰ、Ⅱ和Ⅵ的清除率效果较好，在20min前清除效果优于BHT，20min后BHT对DPPH·清除率增加趋势变大，清除率超过各样品。所测样品中Ⅵ对DPPH自由基清除效果最好，Ⅱ次之，与DPPH·反应比BHT更加迅速灵敏。

图1 各样品及BHT对DPPH自由基的清除作用Fig.1 The DPPH free radical scavenging activity of samples and BHT

按1.2.2.2所述方法，按倍数稀释样品Ⅵ，测定其对DPPH自由基的清除率，不同浓度下的清除率如图2所示。

图2 50%乙醇洗脱部分对DPPH自由基的清除作用Fig.2 The DPPH free radical scavenging activity of 50% ethanol elution

从图2可知，样品Ⅵ对DPPH自由基的清除作用随着反应时间的延长而变大。但因其浓度的不同，其清除效果差距比较大，并与浓度呈量效关系。浓度越高，清除效果越好。

2.2 各样品对·OH的清除作用

按1.2.2.3所述方法，得不同浓度下样品及VC对·OH的清除率，如图3所示。

图3 各样品及VC对·OH清除率Fig.3 The·OH free radical scavenging activity of samples and BHT

从图3可知，随着各样品浓度的增加，对·OH清除效果也随之上升，其清除能力与浓度呈量效关系。当样品处于低浓度时，样品Ⅱ和Ⅵ相对于VC对·OH的清除效果更好；但在高浓度时，其清除效果低于VC。各样品对·OH都具有一定的清除作用，其中样品Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ的清除作用较差；六种样品中Ⅱ的清除效果最好。

2.3 各样品对Fe3+还原能力的测定

按1.2.2.4所述方法，得不同浓度下各样品的吸光值，吸光值越大，其还原能力越好，如图4所示。

图4 各样品还原力的测定Fig.4 The reducing power of samples

从图4可知，随着各样品浓度的增加，其吸光值A也增加。低浓度时，吸光值A增加趋势较慢，低于高浓度时的增加速率。在1000μg/mg时，各样品吸光值由大到小排列为：Ⅵgt;Ⅰgt;Ⅱgt;Ⅳgt;Ⅲgt;Ⅴ。吸光值与各样品浓度呈量效关系，浓度越大，样品吸光值就随之变大，其还原能力就越强。

2.4 各样品对油脂氧化的抑制作用

油脂放置在空气中，容易被氧化产生自由基，而自由基又与空气中的氧气反应生成过氧化物，因此可以用油脂的POV来表示油脂的氧化程度。POV越大，其氧化程度就越高。按1.2.2.5所述方法得各样品及BHT在不同天数的POV值，其结果如图5所示。

图5 各样品及BHT对油脂氧化的抑制作用Fig.5 The inhibiting capacity of oil oxidation of samples and BHT

从图5可知，空白组没有加抗氧化剂，其POV从第1d到第12d一直是最大的。在第10d以前，各样品的POV相差不大；从第10d开始，各样品的POV出现较大差别，即空白组的POV快速增大，样品Ⅴ的POV也迅速增大，表明Ⅴ对油脂氧化没有抑制作用；样品Ⅵ和BHT的POV都处于低位，第12d时，空白组POV为99.56meq/kg，而Ⅵ和BHT的POV值分别为25.23meq/kg和19.68meq/kg，表明样品Ⅵ和BHT两者具有较强的抗油脂氧化作用。

3 结论

对一点红各提取部位以及D101大孔树脂分离后的部位进行体外抗氧化测定，其测定项目包括DPPH自由基的清除能力、·OH清除能力、Fe3+还原能力以及抑制油脂氧化能力。结果表明，各样品具有一定的清除DPPH自由基的能力，但均弱于BHT的清除能力，其中表现最好的是大孔树脂的50%乙醇洗脱部位，其清除能力与样品浓度呈量效关系。通过Fenton体系，测定各样品·OH清除能力，各样品都表现出对·OH具有一定的清除能力，样品中50%乙醇洗脱部位对·OH的清除作用表现最好，但弱于VC的清除能力，其清除能力与样品浓度呈量效关系。在Fe3+还原能力测定中，50%乙醇洗脱部位吸光值最大，其还原能力最强，还原力的大小与其浓度成正相关。此外，在抑制油脂氧化中，50%乙醇洗脱部位表现出较好抑制作用，仅稍弱于强抗氧化剂BHT。

实验结果表明，在各项抗氧化测试中，50%乙醇洗脱部位表现最佳。因此可以推测，一点红抗氧化有效成分存在于50%乙醇洗脱部位中，提示可对该部位进行深度研究，追踪其抗氧化单体成分，为寻找高效的天然抗氧化剂提供实验依据。

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Study on antioxidant activity of extracts of Emilia sonchifolia（Linn.）DC in vitro

WANG Wei1，ZHANG Yan-hua2，LI Chao-hua2，WANG Li-sheng1，*，TANG Jiang-tao1，*
（1.College of Chemistry and Chemical Engineering，Guangxi University，Nanning 530004，China；2.Hua Hong Pharmaceutical Co.，Ltd.，Liuzhou 545005，China）

Objective：To study the antioxidant effects of extracts of Emilia sonchifolia（Linn.）DC.Methods：Get six different parts of the samples by water extraction and alcohol precipitation，organic solvent extraction，macroporous resin purification.Compared with the ascorbic acid and 2，6-di-t-butyl-4-methylphenol，these samples were tested for scavenging effects on the hydroxyl radical and the DPPH free radical，reducing ability and inhibiting capacity of oil oxidation.Conclusion：The results showed that the samples had antioxidant activities，the part of 50%ethanol elution showed the better activity than other samples，but weaker than the ascorbic acid and 2，6-di-t-butyl-4-methylphenol.

Emilia sonchifolia（Linn.）DC；antioxidant activity；macroporous resin；1，1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl；hydroxyl radical；reducing power

TS201.2

A

1002-0306（2012）05-0087-04

2011－05－16 *通讯联系人

王伟（1986-），男，硕士，研究方向：生物有机。

广西科技攻关项目（桂科攻09321054）。