彭大勇,李东斌,李 俊,文 亢,赵文静

(江苏省南京市上海梅山医院,1.肿瘤科;2.病理科,江苏南京,210039)

非小细胞型肺癌包括鳞癌、腺癌、大细胞癌,与小细胞癌相比其癌细胞生长分裂较慢,扩散转移相对较晚,非小细胞肺癌约占肺癌总数的80%～85%[1-2]。趋化因子是指具有吸引白细胞移行到感染部位的一些低分子量趋化因子(多为8-10KD)的蛋白质(如 IL-8、MCP-1等),在炎症反应中具有重要作用[3-4]。现代研究发现[5],巨噬细胞炎性蛋白-1(MIP-1)可以增加黏合素在中性粒细胞上的表达,参与细胞生长、分化、凋亡及组织损伤等过程,目前MIP-1与肿瘤的发生发展已成为了近代研究的热点。本项目通过研究肺癌组织的MIP-1表达与浸润树突状细胞表面趋化因子受体CCR1、CCR7表达的关系,旨在初步探讨肺癌的免疫逃逸机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2007年2月～2010年6月来本院胸外科进行手术治疗的74例非小细胞肺癌作为研究对象,患者术前均未实施放疗或化疗。74例肺癌患者中男 56例,女 18例,年龄 35～72岁,平均(56.8±7.9)岁。经病理学检查:鳞癌31例,腺癌26例,大细胞癌12例,其他类型 5例;按照 1997年国际抗癌联盟(UICC)修订的标准,本研究对患者进行TNM分期:Ⅰ期13例,Ⅱ期31例,Ⅲ期25例(ⅢA期16例,ⅢB期5例),Ⅳ期5例。

1.2 试剂

CCR1,CCR7多克隆抗体及MIP-1原位杂交检测试剂盒均购自上海朗顿生物技术有限公司,其余生化试剂均购自上海朗晟生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫组织化学[6]:标本均采用10%的中型甲醛进行固定,采用甲醛固定的石蜡法进行包埋。采用SYD-S2020切片机切成约5 μ m的薄片,以PBS洗涤2次,每次5 min;再采用二甲苯及梯度乙醇脱蜡至水,抗原微波修复,3%H2O2(80%甲醇)滴加在 TMA上,室温静置10 min,再以PBS洗涤2～3次;滴加正常山羊血清封闭液,室温20 min,甩去多余液体,滴加Ⅰ抗 50 μL,室温静置1 h或者4℃过夜或者37℃1 h,PBS洗3次各 5 min;滴加Ⅱ抗 40～50 μL,室温静置,或37℃1 h,二抗中可加入0.05%tween-20,PBS洗3次各5 min;最后加入抗CCR7多克隆抗体,4℃过夜,再依次加入二抗及卵白素过氧化物酶,DAB显色;以滴加PBS液代替Ⅰ抗作阴性对照。

1.3.2 荧光原位杂交[7]:严格按照博士德公司说明书MIP-1原位杂交检测方法进行操作,首先将切片脱蜡至水化,再在切片上滴加3%柠檬酸稀释的胃蛋白酶消化液,37℃消化处理15 min,然后再以适量蒸馏水进行冲洗,继续以1%低聚甲醛室温固定10 min。杂交过程,在每张切片上滴加20 μL杂交液,放置于38℃恒温箱内进行杂交过夜。杂交结束后,在37℃温度下,采用SSC洗脱液进行洗涤,程序如下:2×SSC洗脱液处理 2次,每次2 min,0.5×SSC洗涤处理2 min,0.2×SSC洗涤处理15 min,最后滴加适量过氧化物酶,于37℃条件下室温30 min,最后采用PBS进行洗涤。

2 结 果

2.1 肺癌组织中MIP-1、CCR1、CCR7表达

免疫组织化学染色结果显示,MIP-1阳性染色细胞为胞膜或胞质有绿色荧光物质表达,癌旁组织中无MIP-1阳性染色细胞出现。CCR1、CCR7阳性表达细胞,为棕黄色或棕褐色,细胞形态各异,呈不规则样分布,有些细胞表面具有较多突起,少许肿瘤细胞核个体较大、胞质也比较丰富,与树突状细胞形态存在显著性差别。

2.2 肺癌组织中MIP-1 、CCR1、CCR7表达与肺癌分期关系

随机抽取Ⅲ、Ⅳ期及Ⅰ、Ⅱ期肺癌组织MIP-1、CCR1、CCR7阳性染色切片,将每张切片上阳性染色细胞计数,取平均值。具体数据见表1,Ⅲ、Ⅳ期肺癌组织中MIP-1阳性肿瘤细胞数量显著多于Ⅰ、Ⅱ期,且差异具有统计学意义。Ⅲ、Ⅳ期肺癌组织中CCR1阳性树突状细胞数量明显多于Ⅰ、Ⅱ期,Ⅲ、Ⅳ期肺癌组织中CCR7阳性树突状细胞数量明显少于Ⅰ、Ⅱ期,差异均有统计学意义,表明 MIP-1、CCR1和CCR7阳性树突状细胞的表达和肺癌分期相关。

表1 不同临床分期患者肺癌组织中MIP-1 、CCR1、CCR7阳性细胞计数(n=10,个)

2.3 肺癌组织MIP-1与CCR1,CCR7阳性树突状细胞表达的关系

肺癌组织MIP-1阳性表达与CCR1阳性树突状细胞呈正相关(r=0.1427,P=0.017);肺癌组织MIP-1阳性表达与CCR7阳性细胞浸润呈明显负相关(r=-0.2148,P=0.023)。

3 讨 论

MIP-1属趋化因子CC家族,是趋化因子受体CCR1的配体,在炎症反应过程中发挥越来越重要的作用。目前,关于趋化因子的研究已经成为当今国内外医学生物学研究的热点之一,它可以快速诱导炎性细胞应答与介导免疫细胞募集和活化。

MIP-1对单核细胞具有趋化活性,可以通过信号转导系统激活单核细胞及巨噬细胞。活化的单核细胞、巨噬细胞的包浆内钙离子浓度升高,超氧阴离子浓度升高,并可以释放溶菌酶,进而上调黏附分子表达水平和相关细胞因子产生,抑制肿瘤细胞生长。除了对单核细胞、巨噬细胞的作用外,MIP-1还可以对嗜碱性粒细胞发挥趋化和激活的作用,导致其脱颗粒和释放组胺增加。处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。CCR1,CCR7为树突状细胞表面两个重要的标记分子,CCR1通过与其配体MIP-1的结合激发一系列生化反应,改变周围细胞的黏附性,便于将细胞信号定位到肿瘤部位。趋化因子受体CCR7(CC chemokine receptor 7)在多种免疫细胞上表达,它及其配体在引导这些细胞向淋巴组织或器官归巢中起主导作用。最近的研究发现[8-9],CCR7在恶性肿瘤细胞上高度表达,并且在肿瘤细胞淋巴道转移过程中起重要作用。

本研究结果发现,肺癌组织MIP-1表达中可检测到表面表达CCR1及CCR7的树突状细胞,且Ⅲ、Ⅳ期肺癌组织中树突状细胞CCR1阳性表达显著高于Ⅰ、Ⅱ期。分析可能的原因是MIP-1通过趋化功能,吸引更多未成熟树突状细胞到达肿瘤局部,而这些细胞无法激发肿瘤特异杀伤性T细胞,甚至诱导产生无能T细胞,从而导致机体免疫应答反应相对较弱,具体的机制还有待于进一步的研究证实。

[1]马 谦.中西医结合治疗中晚期非小细胞型肺癌120例[J].山东中医杂志,2010,29(4):260.

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