张 飞，任海伟，*，张 轶，陈晓前，张志刚，石进才，李胜召

（1.兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730050；2.甘肃金徽酒业集团有限公司，甘肃陇南742308）

白酒糟水解液的美拉德反应条件优化

张 飞1，任海伟1，*，张 轶1，陈晓前1，张志刚2，石进才2，李胜召1

（1.兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730050；2.甘肃金徽酒业集团有限公司，甘肃陇南742308）

以酒糟酸酶联合水解液为原料制备美拉德反应产物。采用单因素实验考察了反应温度、时间和pH 3个因素对美拉德反应褐变程度的影响，并利用正交设计优化反应条件。结果表明，酒糟水解液进行美拉德反应的最佳条件为：温度110℃，时间100min和pH10，该条件下吸光度值为0.995，感官评价反应产物具有独特的酱香味。酒糟酸酶联合水解液进行美拉德反应具有可行性。

白酒糟，水解液，美拉德反应

1 材料与方法

1.1 材料与设备

白酒糟 甘肃金徽酒业集团提供，原料自然风干后粉碎过50目筛，备用；酒糟组成成分为（质量分数） 水分4.05%，灰分7.62%，粗纤维32.06%，淀粉15.05%，粗脂肪3.56%，半纤维素13.27%；3，5-二硝基水杨酸 上海中泰化学试剂有限公司；纤维素酶（滤纸酶活力2000U/g，最适温度45℃，最适pH4.5）和中性蛋白酶（酶活力20000U/g，最适温度50℃，最适pH7.0） 广西南宁庞博生物工程有限公司；糖化酶（20000U/g，最适温度60℃，最适pH4.5） 市售；地衣酚 上海蓝季科技发展有限公司；D-木糖 天津市光复精细化工研究所；其余试剂 均为分析纯。

HH-4恒温水浴锅 国华电器有限公司；恒温油浴锅 自行组装；TDL-5-A离心机 上海安亭科学仪器厂；GZX-9240MBE鼓风干燥箱 海博讯实业有限公司医疗设备厂；Cary 50紫外可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司。

1.2 分析方法

水分含量测定参照GB 5009.3-2010；粗纤维含量测定参照GB/T 5009.10-2003；淀粉含量测定参照GB/T 5009.9-2008；蛋白质含量测定参照GB 5009.5-2010；脂肪含量测定参照GB/T 5009.6-2003；半纤维素含量测定采用VAN SOEST法；木糖含量测定采用地衣酚法；还原糖含量的测定采用3，5-二硝基水杨酸（DNS）比色法；葡萄糖含量的测定采用标准曲线法；蛋白肽的测定采用Lowry法。

1.3 实验方法

1.3.1 酒糟酸酶联合水解液的制备 准确称取一定量酒糟，以1∶10（w/v）料液比加入由HCl和H3PO4组成的质量浓度为2%的混合酸（二者比例相同），搅拌混匀，静置24h后于120℃酸水解2.5h。酸解结束后，快速冷却水解液并调至最适温度和pH，依次加入纤维素酶、糖化酶和中性蛋白酶进行分段酶解，酶解时间均为3h，酶添加量依次为2000U/g纤维素、1000U/g淀粉和2000U/g蛋白质。酶解结束后沸水浴灭酶，然后4000r/min离心15min，收集上清液微滤保存备用。经检测，水解液中蛋白肽质量浓度为6.25g/L，还原糖质量浓度为28.72g/L，其中木糖质量浓度为5.72g/L，葡萄糖质量浓度为11.58g/L。

1.3.2 美拉德反应 将1.3.1方法制备的水解液在预定温度和pH条件下加热一定时间后，冰浴冷却，5000r/min离心10min，除去反应产生的褐色不溶物质，上清液用于分析褐变程度。空白进行同样处理。分别考察温度（70、80、90、100、110、120℃）、时间（20、40、60、80、100、120min）和pH（5、6、7、8、9、10）3个因素对美拉德反应褐变程度的影响。在单因素实验基础上进行L9（33）正交实验（见表1），研究美拉德反应的最佳条件。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal tests

1.3.3 美拉德反应褐变程度的测定 高级阶段的糖裂解和Strecker降解对于美拉德反应至关重要，该过程产生的酮、醛类等小分子物质具有强紫外光吸收，是赋予特征风味的成分。故本文采用分光光度法表征小分子物质的产生速率和产量[13-14]。将酒糟水解液在不同条件下的美拉德反应产物，适当稀释后于200～800nm范围内扫描，发现反应产物的吸收峰均在280nm左右。因此，本文选取反应体系在280nm处的吸光度值（A280）来反映褐变程度。A280越大表示褐色产物的生成量越多[15-16]。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 温度对美拉德反应褐变程度的影响 反应温度是影响美拉德反应的重要参数之一，温度每增加10℃，反应速率就会增加3～5倍。由图1可知，随着温度的升高，A280呈逐渐上升趋势，但上升趋势在90℃后趋于放缓。这是因为，一方面，酒糟水解液中含有诸多的己糖和戊糖成分，尽管戊糖的反应活性高于己糖[17]，但由于木糖等戊糖成分在高温环境下容易转化为糠醛类物质，造成体系中底物浓度下降，反应速率减缓。另一方面，过高的温度会造成蛋白肽的热降解和糖类物质结构的破坏，甚至可能产生致癌物[10]，而且温度高于120℃后，反应产物带有明显的焦糊味等不愉快气味。故初步选择反应温度为100℃。

图1 温度对美拉德反应褐变程度的影响Fig.1 Effect of temperature on browning of maillard reaction

2.1.2 时间对美拉德反应褐变程度的影响 由图2可知，随着反应时间的延长，A280nm呈先增加后减小的趋势，反应80min后A280nm最高，说明美拉德反应产物小分子物质的生成速率和消除速率达到平衡，反应达到终极阶段。若再延长反应时间反而会发生小分子物质的聚合反应，从而使小分子物质的积累表现出一定的消除趋势，导致吸收峰强度迟滞不变，甚至下降[13]。故初步选择反应时间为80min。

图2 时间对美拉德反应褐变程度的影响Fig.2 Effect of time on browning of maillard reaction

2.1.3 pH对美拉德反应褐变程度的影响 美拉德反应的诸多步骤是酸碱催化反应，pH因素至关重要。由表3可知，在pH5～9范围内时，随着pH增加，A280nm逐渐增大。因为，当pH≤7时，Amadori产物主要发生1，2-烯醇化而形成糠醛类物质，该产物在高温酸性条件下会进一步转化为乙酰丙酸，造成吸光度值增加缓慢；当pH介于7～9范围时，反应较快，吸光度值急剧上升，Amadori产物主要发生2，3-烯醇化而形成还原酮和很多裂变产物，产物的风味协同作用增强[7]。从图3还可看出，当pH＞9时，280nm处吸光度值下降，这可能是因为pH过高反而阻碍了美拉德反应由高级阶段向终级阶段的进一步发展，导致大分子褐色物质的生成速率减缓，不利于褐色物质的积累[17-18]。因此初步选择pH为9。

图3 pH对美拉德反应褐变程度的影响Fig.3 Effect of pH on browning of maillard reaction

2.2 正交实验优化设计

在单因素实验结果基础上，选取一定区间内对吸光度值（A280nm）影响较显著的温度、时间和pH 3个因素进行L9（33）正交实验。正交实验结果与方差分析见表2、表3。

表2 正交实验设计及结果Table 2 Results and design test of orthogonal tests

从表2可以看出，各因素对吸光度值的影响大小顺序为C＞A＞B，最优组合为A3B3C3。由表3方差分析结果可知，pH对吸光度值影响显著，其余2因素的影响不显著。综合考虑，确定最佳美拉德反应条件为A3B3C3，即温度110℃，时间100min，pH10。由于组合A3B3C3在上述9组实验中未出现，因此在该最优条件下进行重复验证实验3次，得出反应体系的吸光度值为0.995，美拉德反应产物具有独特的酱香味。

表3 方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal tests

3 结论

白酒糟经酸酶联合水解后，酒糟中的纤维素、半纤维素、淀粉和蛋白质等成分被降解，水解液中富含木糖、葡萄糖等还原糖和蛋白肽成分，具有美拉德反应的物质基础。研究表明，利用酒糟酸酶联合水解液进行美拉德反应的最佳条件为：温度110℃，时间100min和pH10，该最优条件下反应体系的吸光度值为0.995，反应产物具有独特的酱香味。然而，美拉德反应产物的香气成分种类繁多复杂，羰基化合物、呋喃类化合物和烷基吡嗪等小分子物质都可能对香味具有贡献作用[19-20]。因此，美拉德反应产物的组成成分还需要进一步分析研究。

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Optimization of maillard reaction condition for hydrolysates from distiller’s grains

ZHANG Fei1，REN Hai-wei1，*，ZHANG Yi1，CHEN Xiao-qian1，ZHANG Zhi-gang2，SHI Jin-cai2，LI Sheng-zhao1
（1.College of Life Science and Engineering，Lanzhou University of Technology，Lanzhou 730050，China；2.Gansu Jinhui Liquor Industry Group Co.，Ltd.，Longnan 742308，China）

In order to improve the development and utilization of distiller’s grains，maillard reaction was used to produce flavor materials by means of united hydrolysates of acid and enzymatic from distiller’s grains.The effects of the factors such as reaction temperature，time and pH on browning were investigated by single factor experiments based on the absorbance of reaction system.Then the maillard reaction conditions were optimized through the orthogonal experiments based on the preceding results.Results indicated that the optimum conditions were 110℃ of reaction temperature，100min of reaction time and pH10 of reaction pH.Under the optimized conditions for maillard reaction，the absorbency of reaction system was 0.995 and the product was of full-bodied sauce flavor by sensory evaluation.The results improved the depth exploitation and utilization of distiller’s grains.

distiller’s grains；hydrolysates；maillard reaction

TS261.9

B

1002-0306（2012）22-0306-04

中国是一个白酒消费和生产大国，白酒行业每年产生大量的废弃白酒糟（简称酒糟）。一方面由于开发利用不足而造成环境污染，另一方面酒糟中含有丰富的纤维素、淀粉、蛋白质和半纤维素等成分，又造成资源浪费。如何转化利用酒糟生物质资源已成为实现白酒产业循环发展亟待解决的问题。目前，国内外对酒糟的研究主要包括生产燃料乙醇、饲料、木糖醇和沼气、培养食用菌、酿醋、提取酚酸物质等[1-6]。美拉德反应是指还原糖与氨基酸、蛋白质之间的复杂反应。研究表明，糖的反应活性很大程度上取决于其羰基的还原活性[7]，常见糖的反应活性顺序为D-木糖＞L-阿拉伯糖＞己糖（D-半乳糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-果糖）＞二糖（麦芽糖、乳糖、蔗糖），其中葡萄糖和木糖是美拉德反应常用的原料。蛋白酶解物是一种重要的风味增强剂，同时也是美拉德反应的前体物，一般通过热降解反应生成小肽和游离氨基酸或直接通过肽糖交联等方式参与美拉德反应[8-9]。诸如大豆肽、牛肉蛋白肽等动、植物蛋白的酶解物，通过美拉德反应均能为食品带来不同的风味特征[10-12]。酒糟中含有丰富的纤维素、半纤维素、淀粉和蛋白质等成分，经酸酶联合水解后能转化为葡萄糖和木糖等糖分以及蛋白肽组分，这为酒糟水解液进行美拉德反应奠定了物质基础。本文以废弃白酒糟为原料，通过酸酶联合水解将酒糟生物质资源转化为富含木糖、葡萄糖和蛋白肽等组分的水解液，进行美拉德反应。研究反应温度、时间和pH等因素对美拉德反应褐变程度的影响，优化反应条件，为酒糟生物质资源的转化利用奠定理论基础。

2012-06-19 *通讯联系人

张飞（1981-），男，助理研究员，研究方向：食品生物化学。

兰州理工大学学科协调发展计划和甘肃省青年科技基金计划（1107RJYA065）。