刘贝 肖雨 朱丽明 乔新伟 向红丁 陈杰 陈原稼

·论著·

神经中间丝蛋白NF-66与胰岛素瘤良恶性的关系

刘贝 肖雨 朱丽明 乔新伟 向红丁 陈杰 陈原稼

目的探讨神经中间丝蛋白NF-66能否作为判断胰岛素瘤良恶性的分子标志物。方法采用免疫组织化学染色法检测胰岛素瘤组织、瘤旁胰腺组织及3株胰岛素瘤细胞株NF-66蛋白的表达，应用单因素及多因素统计分析胰岛素瘤NF-66蛋白表达与肿瘤病理特征及患者预后的相关性。结果132例胰岛素瘤组织中102例(77%)表达NF-66蛋白,98例瘤旁胰腺组织均未见该蛋白表达(P=4.86×10-31)；3株胰岛素瘤细胞株均高表达NF-66蛋白。118例良性胰岛素瘤中96例(81%)表达NF-66,而14例恶性胰岛素瘤中6例(43%)表达NF-66，恶性胰岛素瘤的表达显著下降(P=0.003)。胰岛素瘤NF-66表达与肿瘤大小(以3 cm为界)、远处转移、远处并淋巴结转移均呈显著负相关(46%比81%,P=0.009；38%比81%,P=0.013；43%比81%,P=0.010)；而与患者性别、年龄、肿瘤复发和生存状态不相关。结论胰岛素瘤中NF-66表达下调与肿瘤的恶性生物学特征有关，可能成为潜在的鉴别胰岛素瘤良恶性的分子标志物。

胰岛素瘤; 中间丝蛋白质类; 诊断，鉴别; 预后

胰岛素瘤是少见的肿瘤,其发生的分子机制尚未阐明[1-3]。临床上主要根据肿瘤有无淋巴结或远处转移以及有无周围组织、器官侵袭来判断其良恶性[1-4]。如果恶性胰岛素瘤处于早期阶段,没有侵袭或转移的证据,单纯依靠病理形态学无法鉴别,因此探索和发现鉴别胰岛素瘤良恶性的分子标志物具有重要临床意义。我们曾采用差异蛋白组学的方法发现神经中间丝蛋白NF-66在胰岛素瘤高表达,而瘤旁组织及正常的胰腺组织中未见表达(结果待发表)。本研究在较大的胰岛素瘤样本和胰岛素瘤细胞株中检测NF-66的表达,探讨其作为鉴别胰岛素瘤良恶性分子标志物的临床价值。

材料与方法

一、标本来源及诊断标准

1990至2010年在北京协和医院就诊并手术切除肿瘤的132例胰岛素瘤患者作为研究对象,96例瘤旁胰腺组织作为对照。胰岛素瘤的诊断标准,参照我们已往发表的文章[5-6]。

二、免疫组织化学法检测NF-66表达

小鼠抗NF-66(MAB5224)购自美国Chemicon公司,兔抗小鼠IgG/HRP购自北京中杉金桥生物试剂有限公司，工作浓度为1∶600。胞质有棕黄着色者为阳性细胞，阳性细胞数占总细胞>20%为表达阳性。免疫组化的全部结果均经过病理医师复查。

三、蛋白质印迹法检测胰岛素瘤细胞株NF-66表达

小鼠和大鼠胰岛素瘤细胞株RIN-m购自北京欣源佳和科技公司，β-TC3、INS-1由中日友好医院娄晋宁教授惠赠。置含10%胎牛血清的DMEM或RPMI1640培养基中培养。常规提取细胞株蛋白,行蛋白质印迹法。NF-66一抗的工作浓度为1∶200,β-actin作为内对照。

四、统计学分析

用SPSS16.0统计软件进行分析。采用χ2检验或Fisher精确检验进行单因素分析,用logistic进行多因素分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、胰岛素瘤患者的临床资料和肿瘤病理特征

132例胰岛素瘤患者中男性54例,女性76例，有2例患者系20年前就诊,性别记载不详；年龄14～74岁，中位年龄44岁。所有患者均为单发。126例有肿瘤部位记载，其中位于胰头颈部62例,胰体尾部64例；131例有瘤体直径记载，其中≥3 cm 13例,<3 cm 118例。病理确诊良性118例,恶性14例。89例患者获得随访，随访2～224个月，随访中位数为37.5个月。81例患者无瘤生存，3例患者带瘤生存(包括2例肿瘤复发者)；3例患者不能明确是带瘤生存还是无瘤生存；2例患者病死于肿瘤。

二、胰岛素瘤组织和瘤细胞株中NF-66表达

胰岛素瘤组织NF-66蛋白表达率为77%(102/132),瘤旁胰腺组织均无NF-66蛋白表达(P=4.86×10-31，图1)。3株胰岛素瘤细胞株均高表达NF-66蛋白(图2)。

图1胰岛素瘤及瘤旁胰腺组织病理改变(a、c)及NF-66蛋白(b、d)表达(免疫组化染色，×100或×200)

图2 3株胰岛素瘤细胞株的NF-66蛋白表达

三、NF-66表达和胰岛素瘤临床病理特征的关系

单因素分析显示，胰岛素瘤NF-66表达与肿瘤大小、良恶性、肿瘤转移呈显著负相关，而与患者性别、年龄、肿瘤复发和患者的生存状态均不相关(表1)。多因素分析显示，NF-66的表达与肿瘤大小、良恶性、肿瘤转移仍然呈显著负相关,与患者预后和肿瘤原发部位呈相关趋势(表1)。

讨 论

胰岛素瘤是最常见的胰腺内分泌肿瘤之一,10%～16%为恶性[2,4]。北京协和医院已收治胰岛素瘤患者400例以上,其中恶性肿瘤比例为4.5%[7]。 虽然绝大部分胰岛素瘤是良性,但毕竟有些患者因为是恶性而最终病死。由于临床上缺乏有效的鉴别肿瘤良恶性的手段,在没有肿瘤转移和侵袭的证据时,通常把肿瘤诊断为良性。本组有1例患者首次入院时因肿瘤仅1.2 cm，无转移和侵袭，诊断为良性胰岛素瘤。10年后患者再次来院就诊,发现肝脏多处转移瘤,而胰腺未见明显占位。因此临床上非常需要鉴别肿瘤良恶性的分子标记物。

表1 NF-66表达与胰岛素瘤临床病理特征的相关性

注：-表示未统计

NF-66是一种分子质量为66000的神经丝蛋白,其在神经系统广泛表达[8-9],并且和神经分化发育有关。NF-66在神经母细胞瘤中高表达[10]。胰岛素瘤是神经内分泌肿瘤中的一员，因此,NF-66在胰岛素瘤广泛表达。本结果显示，胰岛素瘤NF-66蛋白表达率高达77%,在3株鼠源性胰岛素瘤细胞株中也强表达。有价值的发现是恶性胰岛素瘤的表达率较良性胰岛素瘤明显下降甚至不表达。单因素及多因素分析均显示胰岛素瘤NF-66的表达与肿瘤的良恶性、大小、转移呈负相关，提示胰岛素瘤NF-66蛋白的下调与肿瘤的恶性生物学行为相关，因此有可能作为潜在的鉴别胰岛素瘤良恶性的分子标志物。

虽然我们随访了绝大多数的患者,且随访中位数也达到3年以上，但对于病程进展缓慢的神经内分泌肿瘤而言[3],随访的时间仍不够长,因此本组仅发现2例患者病死,3例患者带瘤生存。因例数太少(仅5例),目前尚不能推断该蛋白究竟有无判断预后的价值。

[1] 陈原稼,吴海燕.胰岛素瘤//李兆申,许国铭.现代胰腺病学.北京:人民军医出版社,2006:963-965.

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Expressionofneuronalintermediatefilamentprotein(NF-66)andrelationshipwithbenignandmalignancyofinsulinomas

LIUBei,XIAOYu,ZHULi-ming,QIAOXin-wei,XIANGHong-ding,CHENJie,CHENYuan-Jia.
DepartmentofGastroenterology,PekingUnionHospital，ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,Beijing100730,China

CHENYuan-jia,Email:yuanjchen@gmail.com

ObjectiveTo investigate whether neuronal intermediate filament protein(NF-66) could be used as a molecular marker for the determination of malignancy of insulinoma.MethodsThe expression of NF-66 protein was detected in insulinoma and para-cancerous tissues and 3 insulinoma cell lines by immunohistochemistry staining. The relationship between the expression of NF-66 protein and the clinicopathological characteristics, survival was analyzed by univariate and multivariate statistical analysis.ResultsExpression of NF-66 was found in 102(77%) out of 132 insulinomas and none of 98 paired control (P=4.86×10-31). NF-66 was highly expressed in 3 insulinoma cell lines. The expression of NF-66 was found in 96 (81%) out of 118 benign tumors (P=0.003), while out of 14 malignant insulinomas, 6(43%) were found to express NF-66(P=0.003). The expression of NF-66 was significantly associated with tumor size (3 cm as the cut-off point), distant metastasis (38%vs81%,P=0.013) and distant plus lymph node metastasis (46%vs81%,P=0.009), respectively. The expression of NF-66 was not correlated with age, gender, recurrence and overall survival.ConclusionsDown-regulation of NF-66 was significantly associated with tumor malignancy, suggesting that NF-66 could be a potentially novel molecular biomarker to distinguish malignancy from benign insulinoma.

Insulinoma; Intermediate filament proteins; Diagnosis, differential; Prognosis

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.02.005

国家自然科学基金(30850002、8107205)；北京协和医院卫生部内分泌重点实验室专项基金

100730 北京，中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院消化内科(刘贝、朱丽明、乔新伟、陈原稼),病理科(肖雨、陈杰),内分泌科 卫生部内分泌重点实验室(向红丁、陈原稼)

陈原稼，Email:yuanjchen@gmail.com

2011-08-21)

(本文编辑：吕芳萍)