纪平雄，区志豪，蔡英花，钟楚茵，林 冰

（华南农业大学理学院生物材料研究所，广东广州 510642）

竹叶制备叶绿素铜钠盐的工艺优化研究

纪平雄，区志豪，蔡英花，钟楚茵，林 冰

（华南农业大学理学院生物材料研究所，广东广州 510642）

以竹叶为原料，石油醚与95%乙醇复合溶剂为提取溶剂提取叶绿素，叶绿素提取液直接经过皂化、酸化、铜代、净化和成盐等步骤制备叶绿素铜钠盐。对影响产品得率和质量指标的提取、铜代两个关键工艺过程，利用L9（34）正交实验进行工艺条件优化。结果表明，竹叶叶绿素的最佳提取条件为复合溶剂中95%乙醇体积分数为15%、液固比8∶1（v∶w）、提取温度55℃、提取时间2h；铜代过程最佳条件为乙醇体积分数85%、加铜量为理论值的2倍、反应温度60℃、pH2.5。叶绿素铜钠盐得率0.38%，检验结果主要指标符合食品添加剂国家标准。

竹叶，叶绿素，叶绿素铜钠盐，制备工艺，正交实验

竹子是禾本科（Poaceae）竹亚科（Bambusoideae）多年生常绿植物，全世界约有60个属1200多种，是生长速度最快的植物之一。中国是产竹最多的国家，共有22个属200多种，遍布全国各地。竹叶中含有丰富的叶绿素、黄酮以及生物活性多糖等成分，但在竹子实际应用研究中，往往忽略竹叶的综合利用价值，而被当作废物遗弃，造成极大的浪费[1]。据统计我国现有竹林面积35hm2，竹子约300亿株，以每株竹子年再生竹叶2kg计，竹叶叶绿素含量在0.4%～0.5%计，每年在竹叶中损失掉的叶绿素估计在20M t以上[2]。此外竹叶中含脂质类物质少，易于精制，如用来制备叶绿素铜钠盐等衍生物，将是具有优势的原材料[3]。目前我国叶绿素及其衍生物的制备主要以蚕沙为原料，但随着工业化和城市化进程的加快，使得养蚕业受到制约，影响了叶绿素及其衍生物生产的原料来源[4]。本文介绍了以复合溶剂为提取溶剂提取竹叶叶绿素，连续工艺法制备叶绿素铜钠盐，并以正交实验法探讨了关键步骤的最佳工艺条件。叶绿素铜钠盐比天然的叶绿素更稳定，广泛应用于食品、日用和医药等行业[5]。具有加速伤口愈合、抗癌抗氧化、清除自由基等生理作用，是使用最多的功能性食品添加剂之一[6-7]。因此，本研究为今后竹叶资源实际开发提供一定的理论依据，具有良好的应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

毛竹（hyllostachys heterocycla CV．Pubescens）叶于夏季采之华南农业大学校园内，在室外散开晾晒半天，储存于阴凉干燥处；95%乙醇、石油醚、浓盐酸、氢氧化钠、硫酸铜 均为分析纯；其他使用的无机和有机试剂 均为国产分析纯。

JJ300精密电子天平 常熟双杰测试仪器厂；恒温水浴锅 江苏省金坛市江南仪器厂；UV2550紫外可见分光光度计 日本岛津公司；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司；RE-20000旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 叶绿素含量的测定 叶绿素的测定参照喻薇等方法进行[8]。

1.2.2 叶绿素的提取和叶绿素铜钠盐的制备 称取30g毛竹叶，加入石油醚和95%乙醇复合溶剂提取叶绿素2次，合并叶绿素提取液，再加入一定浓度的NaOH乙醇溶液，调节pH 12～13，60℃水浴皂化，静置分层。下层皂化液加等体积的石油醚洗涤后，用盐酸调节pH2～3，然后加入质量分数20%硫酸铜溶液，进行铜代反应，反应完成后加水使叶绿素铜酸析出。将叶绿素铜酸溶于丙酮中，加入NaOH乙醇液，调节pH11～12，滤取析出的晶体并干燥，得到墨绿色有金属光泽的叶绿素铜钠盐[9]。

1.2.3 叶绿素提取和铜代过程的正交实验 参考文献[8]有关单因素实验结果，采取L9（34）正交实验法分别对叶绿素提取和铜代两个关键过程的影响因素进行研究。叶绿素提取选择所用复合溶剂体积与投料竹叶质量之比（液固比）、复合溶剂中95%乙醇体积分数、提取温度、提取时间作为实验因素。正交实验因素水平表见表1。

表1 L9（34）叶绿素提取的正交实验因素水平表Table 1 The level of L9（34）orthogonal experiment factors of chlorophyll extracting

叶绿素铜代过程以加铜量、溶剂乙醇体积分数、反应温度及pH作为实验因素，反应时间均为1h。正交实验因素水平表见表2。

表2 L9（34）叶绿素铜代的正交实验因素水平表Table 2 The level of L9（34）orthogonal experiment factors of chlorophyll copper replacement

参照文献[10]，叶绿素提取以叶绿素提取含量判定提取效率，叶绿素铜代以铜代率判定反应的进行程度，得出最适工艺条件。

1.2.4 叶绿素铜钠盐质量的检验 叶绿素铜钠盐主要质量指标是产品的吸收光谱最大吸收波长、pH、消光比、特殊消光值、总铜和游离铜，均参照国家标准GB 3262-1982《食品添加剂叶绿素铜钠盐》规定方法进行检验[11]。

2 结果与分析

2.1 叶绿素铜钠盐制备的连续工艺过程

从蚕沙和植物中提取叶绿素的研究报道多用丙酮或乙醇为提取溶剂，高效率的复合溶剂提取方法少有报道，以石油醚和乙醇作复合溶剂从原料中高效率提取叶绿素更为鲜见。石油醚对叶绿素和类脂物质的溶解能力强，但对竹叶的渗透性差。由于晒干的竹叶仍然含有少量水分，有利于乙醇的渗透。乙醇对叶绿素有一定的溶解度，但对类脂物质的溶解能力较之石油醚弱，而对某些极性杂质溶解能力强。石油醚和乙醇两者复合使用，可以起到互补作用，利用乙醇对竹叶的渗透性，可使叶绿素在复合溶剂液相和竹叶固相之间较快达到溶解平衡。得到的叶绿素提取液中类脂和极性杂质都较使用单一溶剂大大减少，有利于后续工艺步骤。

常见的叶绿素铜钠盐的制备过程，都是叶绿素提取液回收溶剂后得到油状的叶绿素，再溶解于石油醚，加入氢氧化钠乙醇溶液皂化。使用石油醚和乙醇复合溶剂则无需先回收溶剂，可直接加入氢氧化钠乙醇液皂化，此时乙醇浓度仍可保持皂化步骤所要求的75%～ 80%浓度，确保皂化完全。这样就有效地减少溶剂回收过程的能量消耗，缩短了操作时间，降低了生产成本。此外，石油醚和乙醇复合溶剂提取叶绿素，叶绿素提取液杂质大为减少，皂化后得到的皂化液杂质也少。随后的酸化和铜代步骤的条件控制也变得容易，反应过程条件控制的稳定性也提高，最终所得到的叶绿素铜钠盐产品的质量指标也呈现很高的重现性。

2.2 叶绿素提取和铜代过程的正交实验优化

表3 叶绿素提取的L9（34）正交正交实验设计和结果Table 3 Results of L9（34）orthogonal experimentof chlorophyll extracting

从表3中极差（R）可知C＞B＞A＞D，说明作为提取溶剂的复合溶剂95%乙醇在石油醚中的体积分数和提取时间是影响竹叶提取叶绿素的关键因素，提取剂的用量即复合溶剂对竹叶的液固比的影响也是比较大的，提取温度的影响最小。由表3中的各实验因素的平均值可以得出，竹叶提取叶绿体色素的效率最高的组合条件是A3B3C2D1或A3B3C3D1，但考虑到叶绿素在加热条件下时间长容易氧化降解，以及实际生产中时间延长带来的能量消耗的增加，因此选择A3B3C2D1作为最佳提取条件。即以复合溶剂体积与投料竹叶质量之比液固比8∶1（v∶w），乙醇体积分数15%的乙醇石油醚复合溶剂作提取溶剂，在50℃温度下提取2h。连续提取2次，测定提取液叶绿素，相当竹叶叶绿素提取含量4.98mg/g。这是因为在复合溶剂中的乙醇较之使用丙酮或乙醇单一溶剂所占体积分数少，而叶绿素的提取取决于乙醇对竹叶的渗透，因而时间的影响在开始显得尤为显著，2h后达到渗透平衡后趋于稳定。并且复合溶剂中乙醇体积分数少于15%时，就会使竹叶体乙醇浓度达不到75%的要求，叶绿素就难以被提取出来。此外，竹叶比重小，所占容积大，提取时必须保证溶剂浸过竹叶表面，否则造成溶剂与竹叶不能充分接触，导致叶绿素难以提取完全。相比之下，温度在50～60℃之间，区别不太大[12-13]。

表4 叶绿素铜代的L9（34）正交正交实验设计和结果Table 4 Results of L9（34）orthogonal experimentof chlorophyll copper replacement

竹叶制备叶绿素铜钠盐工艺过程中的铜代步骤，铜代率的大小是决定其主要质量指标吸收波长、消光比、特殊消光值、总铜、游离铜等是否合符规定标准的关键，因而必须严格地控制好影响铜代步骤的主要条件。从表4的数据极差（R）可以得出A＞D＞B＞C，加铜量和pH的控制对铜代率的影响最为显著。这是由于铜代是在酸性条件下进行，皂化步骤得到的叶绿素镁钠此时转化为脱镁叶绿酸，脱镁叶绿酸在合适的pH条件下溶解于乙醇。在pH偏高时脱镁叶绿酸和铜代生成的叶绿素铜酸析出浮于表面，硫酸铜则析出沉淀。在pH偏低时铜代率偏低且后续净化步骤操作困难。再者铜代液中夹有其他干扰杂质且脱镁叶绿酸浓度低，因而铜代液中必须有足够的硫酸铜浓度，才能确保铜代完全。但硫酸铜浓度偏高也不行，偏高往往使游离铜指标偏高；溶剂浓度的影响虽然不及加铜量和pH，但控制不好也对铜代率有较大影响，因为硫酸铜溶于水而不溶于90%以上高浓度乙醇溶剂，85%左右乙醇浓度才能保证反应物在均相条件下进行；至于反应温度，随着脱镁叶绿酸不断转化为叶绿素铜酸，由原来对光和热的不稳定变得越来越稳定，对叶绿素铜钠盐产品质量指标影响不大。控制60℃左右除了维持铜代液的均相，提高反应速度，防止温度过高，主要还是避免乙醇挥发，保持铜代液中乙醇浓度的稳定。最优组合为A2B2C2D2即加铜量按理论值的2.0倍、乙醇体积分数85%、反应温度60℃、pH2.5为叶绿素铜钠盐生产铜代过程的最适工艺条件[14]，最优工艺条件制备叶绿素铜钠盐，铜代率为58.2%～59%。

2.3 叶绿素铜钠盐产品检验结果

按最优工艺条件制备叶绿素铜钠盐3次，所得产品主要指标检验结果见表5。

由表5可知，叶绿素铜钠盐的各项主要指标均符合国家规定标准。用UV2550紫外可见分光光度计，在300～800nm波长范围内进行光谱扫描，可见叶绿素铜钠盐在405、630nm处有两个重现性极高的最大吸收峰，且在405nm处的波峰最高。查文献得叶绿素铜钠盐有两个最大峰范围404～406nm和629～631nm，实验发现，这与铜代率有关系，铜代率由铜络合量即实际铜代质量决定，偏于规定值4～6高侧则重现性在405、630nm高。和文献所记载叶绿素的紫外吸收比较，叶绿素铜钠盐的吸收峰位置明显蓝移，且叶绿素铜钠盐在630nm的吸收与叶绿素在660nm附近的吸收相比大大减少，这就是叶绿素铜钠盐的消光比比叶绿素大得多的原因[4]。此外，铜代率越低，产品中所含的脱镁叶绿素类化合物就越多，而脱镁叶绿素类化合物呈灰褐色，这样就直接影响到产品的色泽度，甚至使其呈现枯叶黄色，从而影响其作为天然着色剂的产品质量，高铜代率的叶绿素铜钠盐色彩及稳定性更好。检测结果表明，所制备的叶绿素铜钠盐纯度是高的[15]。

3 结论

以竹叶为原料，石油醚与95%乙醇复合溶剂为提取溶剂提取叶绿素，叶绿素提取液直接经过皂化、酸化、铜代、净化和成盐等步骤制备叶绿素铜钠盐。对影响产品得率和质量指标的提取、铜代两个关键工艺过程，利用L9（34）正交实验进行工艺条件优化。结果表明，竹叶叶绿素的最佳提取条件为复合溶剂中95%乙醇体积分数15%、液固比8∶1（v∶w）、提取温度50℃、提取时间2h；置铜过程最佳条件为乙醇体积分数85%、加铜量为理论值的2.0倍、反应温度60℃、pH 2.5。以最佳工艺条件制备的叶绿素铜钠盐得率0.38%，检验结果主要指标符合食品添加剂国家标准。与常见的回收溶剂得到的叶绿素糊，再溶于石油醚后加氢氧化钠皂化的方法相比，连续工艺法简化了工艺，节省了操作时间和材料消耗。

表5 叶绿素铜钠盐产品各项指标测定结果Table 5 Main quality index of sodium copper chlorophyllin

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Research of optim ization of preparation technology of sodium copper chlorophyllin from bamboo leaves

JIPing-xiong，OU Zhi-hao，CAIYing-hua，ZHONG Chu-yin，LIN Bing
（Institute of Biomaterial，College of Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China）

Bamboo leaves were used as raw material，and the com posite solvent of petroleum ether and 95% ethanolwas used as extraction solventofchlorophyll.Chlorophyllextracted d irectly after the step ofsaponification，acid ification，copper rep lacement，purification，salt formation and so on were p repared as the sodium copper chlorophyllin.There were two key p rocesses，one was the extraction p rocessesac tion which affected the p roduc t yield and the other was copper rep lacement p rocessesaction which affected the quality ind icators respectively.The p rocess cond itions were op tim ized by L9（34）orthogonal test.The result showed op timum extraction conditions of the bamboo leaves chlorophyllwere 15%of the volume fraction of 95%ethanol in the com posite solvent，taking the composite solvent eight times the volume of bamboo leaves as extractant，ratio of liquid to solid 8∶1（v∶w），extraction temperature 55℃，extraction time 2h.Best p rocess conditions of copper rep lacement were the ethanol volume fraction of 85%，the increase of copper content was two times of the theoretical value，reac tion tem perature 60℃，pH2.5.The p roduct yield of sodium copper chlorophyllin was 0.38%.Main indicators of the test resultwere in accordance w ith the national standards of food add itives.

bamboo leaves；chlorophyll；sod ium copper chlorophyllin；p reparation technology；orthogonal test

TS201.1

B

1002-0306（2012）22-0323-04

2012－06－11

纪平雄（1956-），男，副教授，研究方向：应用化学与生物资源利用。

华南农业大学“211工程”三期重点建设项目（2009B010100001）。