周存山，余筱洁，马海乐，*，戴梦瑶，马 寅，邱桂华，张建振

（1.江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江 212013；

2.浙江农林大学农业与食品科学学院，浙江临安 311300）

猪睾丸蛋白酶解抗氧化肽工艺优化及抗氧化研究

周存山1，2，余筱洁1，马海乐1，*，戴梦瑶2，马 寅2，邱桂华2，张建振2

（1.江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江 212013；

2.浙江农林大学农业与食品科学学院，浙江临安 311300）

采用中性蛋白酶酶解猪睾丸蛋白制备抗氧化肽。以还原力为指标，通过正交实验设计，确定了酶解猪睾丸蛋白制备抗氧化肽的工艺条件：底物质量浓度8%，起始pH7.0，酶用量360U/g（新鲜猪睾丸），温度37℃，时间90min，相应指标还原力0.997。通过体外抗氧化活性的研究，发现猪睾丸抗氧化肽对·OH、H2O2、DPPH·和卵黄脂蛋白的IC50分别为0.47、0.56、0.86、0.42g/L。

猪睾丸，酶解，肽，自由基，抗氧化

食品的氧化变质以及人体本身代谢过程中产生的自由基均会对细胞和组织造成严重的氧化损伤，从而导致动脉硬化、心血管疾病、癌症和身体衰老等疾病。将抗氧化剂作为食品添加剂添加到日常膳食中，可以清除自由基对人体的危害。由化学工艺制得的抗氧化剂如BTA（叔丁基羟基茴香醚）、BHT（二叔丁基羟基甲苯），虽然抗氧化效果良好，但对人体肝、脾、肺有害，具有蓄积性致癌作用[1]。因此，人们逐渐把目光转向低价、低毒、高效的天然食品抗氧化剂。猪睾丸不仅价格便宜，而且营养丰富，蛋白质含量非常高，是生产天然活性物质理想的原料。通过实验可以更好地充分利用猪睾丸，研究其抗氧化性，探索制备高效抗氧化肽的途径，从而拓展以猪睾丸为食品添加剂类食品的应用范围与目的，拓宽动物蛋白功能性食品的开发利用。有效地利用了我国丰富的猪肉加工产业的副产品资源，将产生巨大的经济和社会效益。总之，利用现代高新技术开发高附加值产品，进一步提高动物副产品的利用率，对动物副产品的工业化和生态环境保护都具有重要意义。酶解物抗氧化活性的强弱根据还原力的大小来判断，以还原能力的大小为评价指标，进行工艺优化研究，确定具有成本低、重复性好、安全可靠、易操作、高得率等优点的最佳酶解条件。影响蛋白质酶解的因素主要有时间、pH、温度、酶用量与底物浓度等[2]。研究以还原力为指标，设计四因素三水平的正交实验对中性蛋白酶（中性蛋白酶在pH调节上比较温和，不需要添加大量的碱液[3-4]）水解猪睾丸的组合条件进行优化；进一步进行体外抗氧化研究，包括清除羟自由基（·OH）的能力、H2O2的清除作用、清除DPPH·的能力和抗脂质过氧化作用。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

中性蛋白酶 酶活6000U/g，国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钠、三氯乙酸、铁氰化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、三氯化铁、硫酸亚铁、双氧水、水杨酸、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、硫代巴比妥酸等均为分析纯试剂 采购于杭州禾德化工有限公司；将新鲜的猪睾丸洗净后，修整再切块，绞碎成肉糜，称取适量猪睾丸，加入一定蒸馏水打浆，配制一定浓度的溶液。

PHS-2C精密酸度计 上海精密科学仪器有限公司；方型恒温数显水浴锅 国华电器有限公司；JJ-1精密增力电动搅拌器 常州赛普实验仪器厂；TDL-5-A低速台式离心机 上海安亭科学仪器厂；紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酶解工艺流程 猪睾丸溶液→50℃预热10min→中性蛋白酶酶解90min→沸水保温20min灭酶→4000r/min离心15min→上清液→指标测定

1.2.2 酶解工艺优化 根据动物蛋白酶解文献[3-4]，选择温度（A，℃）、底物浓度（B，%）、酶用量（C，U/g新鲜猪睾丸）、反应起始pH（D）作为实验因素，以还原力为指标对猪睾丸的中性蛋白酶水解参数作正交优化实验，因素水平设计见表1。按正交实验所获得的最佳酶解条件，对猪睾丸进行酶解，酶解液经离心后取上清液冷冻干燥，测酶解物抗氧化能力。

表1 正交实验设计因素与水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal design

1.2.3 酶解产物抗氧化活性测定

1.2.3.1 还原力的测定 参考Mezrameto等[5]的方法并略作改动。取样品lm L，加入磷酸盐缓冲溶液（0.2mol/L，pH 6.6）2.5m L和1%铁氰化钾2.5m L，50℃保温20m in，加入10%的三氯乙酸5m L，充分混合，移取上清液2.5m L，加入2.5m L蒸馏水和0.5m L 0.1%的三氯化铁溶液，静置10m in，以蒸馏水调零，于700nm处测定吸光值，吸光值增加表明还原力增强。

1.2.3.2 清除羟自由基（·OH） 采用邻二氮菲Fe2+氧化法[6]具体方法：取2m L样品，加入0.2m L 6mmol·L-1FeSO4、6mmol·L-1H2O2，混合后静置10m in，再加入2m L 6mmol·L-1水杨酸，混匀，静置30m in，在510nm处测其吸光值记为A·OH-1，当蒸馏水代替水杨酸时的吸光值记为A·OH-2，空白对照组以蒸馏水代替样品，吸光值记为A·OH3。按照下式计算对·OH的清除率Y·OH（%）=[1-（A·OH-1-A·OH-2）/A·OH-3]×100

1.2.3.3 清除H2O2的测定 将不同浓度样品溶于3.4m L 0.1mol·L-1的磷酸缓冲液（pH 7.4）中，加入0.6m L 4mol·L-1H2O2溶液，放置10min后，混合液在230nm下测定吸光值，以不加样品上的H2O2溶液作对照[7]。对H2O2的抑制率：YH2O2（%）=[（AH2O2-1-AH2O2-2）/AH2O2-1]×100，式中，AH2O2-1―不加样品的吸光度；AH2O2-2―加入样品的吸光度。

1.2.3.4 清除DPPH·的测定 在2m L新配制的DPPH·溶液（20mmol·L-1）中加入2m L不同浓度样品，室温暗光下反应30min，在517nm处测吸光值。清除DPPH·：YDPPH（%）=[ADPPH-3-（ADPPH-1-ADPPH-2）/ADPPH-3]×100，式中，ADPPH-1―加入样品和DPPH·时的吸光度；ADPPH-2―加入样品，但不加入DPPH·时的吸光度；ADPPH-3―不加样品，加入DPPH·时的吸光度。

1.2.3.5 抗脂质过氧化作用 以卵黄脂蛋白为底物的LPO模型反应体系包括：体积比为1∶25稀释的卵黄悬液（卵黄用等体积的pH 7.45，0.lmol/L磷酸盐缓冲溶液（PBS）配成，使用前磁力搅拌10m in，一定浓度的样品溶液0.lm L、25mmol/L FeSO4·7H2O溶液0.2m L，用PBS补足至2.0m L[8]。对照不加样液外其他试剂同前，并提前加入质量分数为20%TCA溶液0.5m L。将上述2种试管同时置于37℃恒温水浴锅中保温培养1h。取出后，加入20%TCA 0.5m L，静置10m in后，与对照管于3500r/min离心10min，取2.0m L上清液，分别加入质量分数为0.8%硫代巴比妥酸（TBA）溶液1.0m L，加塞于100℃水浴15min，取出冷却。空白管以2.0m L PBS溶液代替，在532nm下测定吸光度，样品对卵黄脂蛋白LPO的抑制率表示：YLPO（%）=（ALPO-1-ALPO-2）/ALPO-1× 100，式中，ALPO-1―不加样品的吸光度；ALPO-2―加入样品的吸光度。

2 结果与分析

2.1 酶解工艺优化

猪睾丸抗氧化肽酶解工艺正交优化见表2，根据表2中各因素的极差大小可看出，各因素对还原力影响的主次顺序为：D＞C＞A＞B，即起始pH＞酶用量＞温度＞底物浓度。基于还原力获得最优组合A1B2C2D2，即水解温度为37℃、底物浓度为8%、酶用量为360U/（g新鲜猪睾丸）、起始pH为7.0、时间90m in。在此条件下进行3次验证实验，猪睾丸酶解物的还原力为0.997，说明得到的最优组合是合理的。

表2 实验设计及结果Table 2 The experimental design and results

2.2 最优条件下产物抗氧化结果分析

2.2.1 酶解产物的羟自由基（·OH）清除率 酶解产物对·OH的清除率如图1所示。

由图1可知，猪睾丸酶解物中抗氧化肽对羟自由基的清除率随浓度的增加而增强，其清除效果呈线性的量效关系。当浓度为1g/L时，清除率达81.5%。水解物对·OH有较强的清除能力，可能跟·OH极强的氧化能力及肽类能与Fe2+鳌合在一起有关。由于·OH极强的氧化能力能将所有的有机质都氧化反应，从而使肽类易于被氧化，并且肽类也有可能与Fe2+鳌合在一起从而减缓了Fenton反应产生·OH。通过对浓度与清除率间的回归分析，可以得到猪睾丸抗氧化肽的半抑制浓度IC50为0.47g/L。

图1 猪睾丸酶解物对·OH的清除率Fig.1 Radical（·OH）scavenging of peptides from swine testis

2.2.2 酶解产物的H2O2清除率 酶解产物对H2O2的清除率实验结果如图2所示。

图2 猪睾丸酶解物对H2O2的清除率Fig.2 H2O2 scavenging of peptides from swine testis

由图2可知，随着样品浓度的增大，猪睾丸酶解物中的抗氧化肽对H2O2的清除效果也随着浓度的增大迅速增强，呈量效关系。当浓度为1g/L时，清除率高达78.57%。通过对浓度与清除率间的回归分析，可以得到猪睾丸抗氧化肽的半抑制浓度IC50为0.56g/L。

2.2.3 酶解产物的DPPH·清除率 酶解产物对DPPH·的清除率实验结果如图3所示。

图3 猪睾丸酶解物对DPPH·的清除率Fig.3 DPPH·scavenging of peptides from swine testis

由图3可知，猪睾丸酶解物中抗氧化肽对DPPH·的清除率跟其浓度具有量效关系，其清除率随着浓度的增大而增大。当浓度为1g/L时，清除率为55.4%。通过对浓度与清除率间的回归分析，可以得到猪睾丸抗氧化肽的半抑制浓度IC50为0.86g/L。

2.2.4 酶解产物的抗脂质过氧化活性 酶解产物的脂质抗氧化实验结果如图4所示。

图4 猪睾丸酶解物的脂质抗氧化作用Fig.3 Radical（Lipids）scavenging of peptides from swine testis

由图4可知，猪睾丸酶解物对Fe2+诱发的卵黄脂蛋白过氧化的抑制是逐步线性增加的过程。当浓度为1.0g/L时，抑制作用最大，抑制率高达85.3%。通过对浓度与清除率间的回归分析，可以得到猪睾丸抗氧化肽的半抑制浓度IC50为0.42g/L。

3 结论

以猪睾丸蛋白为原料，用酶解法获得抗氧化肽，还原力为过程指标，研究了猪睾丸抗氧化肽的酶解工艺优化，在此基础上，对制备的猪睾丸酶解物的体外抗氧化活性进行研究。

3.1 获得中性蛋白酶水解猪睾丸的最优工艺条件为：酶的添加量为360U/（g新鲜猪睾丸），酶解温度37℃，起始pH7.0，底物浓度8%，时间90min。在该酶解条件下猪睾丸酶解物的还原力达到0.997。

3.2 根据确定的最佳酶解工艺来制备猪睾丸酶解物，考察了其对羟自由基（·OH）、H2O2和DPPH·的清除效果，以及对卵黄脂蛋白氧化的抑制作用四个方面。结果发现：该酶解物对·OH和H2O2具有较好的清除作用，对DPPH·也具有一定的清除效果，酶解物对Fe2+诱发的卵黄脂蛋白的过氧化抑制作用最强。

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Enzymatic optim ization and antioxidant activities of peptides from sw ine testis

ZHOU Cun-shan1，2，YU Xiao-jie1，MA Hai-le1，*，DAIM eng-yao2，MA Yin2，QIU Gui-hua2，ZHANG Jian-zhen2
（1.School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China；
2.School of Agriculture and Food Science，Zhejiang A&FUniversity，Lin’an 311300，China）

This artic le focused on neutral p rotease hyd rolysis of sw ine testis p rotein for ob tain antioxidant pep tides.The conditions of enzymatic hyd rolysis of sw ine testis p rotein for antioxidant pep tides were designed and obtained w ith orthogonal by using the reducing power index：substrate concentration 8%，pH7.0，enzyme dosage 360U/g（fresh sw ine testis），tem perature at37℃and time 90m in.The reducing power of the hyd rolysis of sw ine testis under the condition was 0.997.The IC50of·OH、H2O2、DPPH rad ical-scavenging and yolk lipop rotein were 0.47、0.56、0.86、0.42g/L，respectively.

sw ine testis；enzymatic hyd rolysis；pep tide；radicals；antioxidant

TS251.1

B

1002-0306（2012）22-0284-04

2012－06－12 *通讯联系人

周存山（1979-），副教授，主要从事天然产物资源化及功能化研究。

浙江省自然科学基金（Y3110025）；重点实验室开放基金（2010F30003，JAPP2010-4）。