李 波，包怡红，高 锋，王振宇，*

（1.东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨 150040；

2.黑龙江省农业科学院科研处，黑龙江哈尔滨 150086；

3.黑龙江省农业科学院，黑龙江哈尔滨 150086）

大孔树脂纯化红松松球鳞片多酚及其抗氧化活性研究

李 波1，2，包怡红1，高 锋3，王振宇1，*

（1.东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨 150040；

2.黑龙江省农业科学院科研处，黑龙江哈尔滨 150086；

3.黑龙江省农业科学院，黑龙江哈尔滨 150086）

通过吸附和解吸实验，从树脂ADS-7、S-8、NKA-9、NKA-Ⅱ、HPD600、AB-8、X-5、D101、D3520中筛选出了适合纯化红松松球鳞片多酚的大孔树脂，并确定纯化工艺参数。结果显示，AB-8树脂为吸附分离红松松球鳞片多酚类物质的优良材料，纯化工艺条件为：上样体积为0.3BV，上样浓度为1.5mg/mL，上样后静态吸附3h，水洗3BV，洗脱剂为90%乙醇，洗脱剂用量为1.6BV。在此条件下，多酚的纯度由12.51%提高到35.07%。同时对纯化前后的抗氧化活性进行了比较。结果表明，红松松球鳞片多酚经纯化后还原Fe3+的能力和清除DPPH自由基的能力都强于粗提物。

大孔树脂，纯化，红松松球鳞片，多酚，抗氧化活性

近年来研究发现松科植物体内含有大量多酚类物质，该类物质具有抗氧化[1]、降血脂[2]、抗癌[3]、抗辐射[4]、抑菌消炎和抗病毒[5]等功能，可广泛应用于食品、医药、化妆品、保健品及高分子材料等领域。我国的红松资源丰富，但对其体内多酚类物质的研究还很少。红松松球鳞片作为松子的副产物，常常被废弃，因此有必要综合开发利用该资源。红松松球鳞片乙醇提取物中含有许多杂质，为更好地对多酚类成分进行研究，必须采取有效的方法纯化提取物。大孔吸附树脂作为一种高分子聚合物吸附剂，具有不溶于酸、碱及有机溶剂，对有机物选择性好，不受无机盐类低分子化合物存在的影响等优点，近年来在天然产物分离纯化方面应用越来越广泛。但应用大孔树脂纯化红松松球鳞片多酚的研究还未见报道。本实验筛选了适合红松松球鳞片多酚类物质纯化的树脂，并对纯化工艺进行研究；同时对红松松球鳞片多酚纯化前后的抗氧化活性进行了对比，以期为红松松球鳞片多酚的产业化开发和综合利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红松松球鳞片 收集于黑龙江省伊春林区；不同型号的大孔树脂ADS-7、S-8、NKA-9、NKA-Ⅱ、HPD600、AB-8、X-5、D101、D3520 购于南开大学化工厂；DPPH Sigma公司；福林酚、无水碳酸钠、无水乙醇、氢氧化钠、盐酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、铁氰化钾、氯化铁、三氯乙酸 均为国产分析纯。

DFY-500摇摆式高速中药粉碎机 温州市大德中药机械有限公司；DK-8D电热恒温水槽、DHG-9240电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；SHB-ⅢG循环式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司；RE-5205旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；FA2004电子天平 上海天平仪器厂；722可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；HZS-HA水浴振荡器 中国·哈尔滨东联电子技术开发有限公司；FD-1E-50冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；TU-1810紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 红松松球鳞片多酚提取液的制备 红松松球鳞片原料，自然晾干后粉碎过60目筛。称取一定量的鳞片粉末，根据前期实验优化的提取条件，加57%乙醇、液料比27∶1，80℃的恒温水浴中浸提4h。浸提完成后迅速冷却，抽滤除去不溶物，旋转蒸发回收乙醇，制得一定浓度的提取液。

1.2.2 多酚含量（浓度）测定 采用福林酚法测定多酚含量[6]。以没食子酸为标准品对照计算样品中多酚含量，标准曲线方程为：A=3.7955C+0.02，式中，A表示吸光值；C表示没食子酸浓度（mg/m L）。根据标准曲线方程可导出多酚含量的计算公式：

式中，N为稀释倍数；A′为1m L稀释液的吸光值。

1.2.3 树脂的预处理与装柱 树脂预处理：大孔树脂用95%乙醇充分浸泡24h后，乙醇洗涤，直至洗出液加适量水无白色混浊，再用蒸馏水洗至无醇味。然后用4%的盐酸溶液浸泡3h，蒸馏水洗至中性，接着用5%的氢氧化钠溶液浸泡3h，蒸馏水洗至中性，备用[7]。

装柱：采用湿法装柱。先在柱内倒入一定量的蒸馏水，然后将预处理后的湿树脂，沿着玻璃棒加入柱中。同时开启柱底活塞，让水从底部缓缓流出，使树脂自然沉降而不留气泡。

1.2.4 大孔树脂的筛选 称取不同型号真空抽干的树脂各10.0g，分别置于150m L三角瓶中，各加入50m L一定浓度的提取液，25℃水浴振荡吸附24h，测定此时溶液中多酚浓度。滤出提取液后，用蒸馏水洗去树脂表面的多酚溶液，再各用50m L 70%乙醇溶液于相同条件下解吸，测定解吸液中多酚浓度。分别按照下列公式计算吸附量、吸附率、解吸率和回收率，从中筛选出性能优良的树脂进行后续实验。

式中，C0为原液中多酚浓度，C1为吸附液中多酚浓度，C2为解吸液中多酚浓度，V0为吸附原液体积，m为树脂质量。

1.2.5 AB-8树脂静态吸附动力学曲线的绘制 准确称取10.0g真空抽干的AB-8树脂，放入150m L三角瓶中，加入50m L多酚提取液，25℃水浴振荡吸附6h，分别于1、2、3、4、5、6h测定多酚浓度，计算吸附率，并绘制吸附动力学曲线。

1.2.6 AB-8树脂纯化红松松球鳞片多酚的研究 将预处理后的AB-8树脂装入1.5cm×40.0cm的柱中，树脂柱体积（BV）66m L，待柱平衡后，取一定量多酚提取液，在不同条件下通过树脂柱，以确定最佳的上样体积、上样浓度、水洗体积、洗脱剂浓度和洗脱剂体积。

1.2.6.1 上样体积的考察 分别量取8、12、16、20、24m L浓度为1mg/m L的多酚溶液上柱，吸附3h，然后用2BV的蒸馏水洗脱，再用2BV 70%的乙醇洗脱，收集洗脱液，测定其多酚含量并计算回收率。

1.2.6.2 上样浓度的考察 分别量取20m L浓度为0.5、1、1.5、2、2.5mg/m L的多酚溶液上柱，吸附3h，然后用2BV的蒸馏水洗脱，再用2BV 70%的乙醇洗脱，收集洗脱液，测定其多酚含量并计算回收率。

1.2.6.3 水洗体积的考察 量取20m L浓度为1.5mg/m L的多酚溶液上柱，吸附3h，然后用蒸馏水洗脱树脂柱。最佳的水洗体积以流出的水溶液透明时最为适宜。

1.2.6.4 洗脱剂浓度的考察 各取20m L浓度为1.5mg/m L的多酚溶液上柱，吸附3h，然后用3BV的蒸馏水洗脱，再分别用40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇洗脱2BV，收集洗脱液，测定其多酚含量并计算回收率。

1.2.6.5 洗脱剂体积的考察 量取20m L浓度为1.5mg/m L的多酚溶液上柱，吸附3h，然后用3BV的蒸馏水洗脱，再用90%乙醇进行洗脱，每5m L收集一管，并测定各管洗脱液中的多酚含量，以洗脱液体积为横坐标，洗脱液中多酚浓度（mg/m L）为纵坐标，绘制洗脱曲线，确定洗脱剂体积。

1.2.7 多酚纯度的测定 精确称取一定质量的粗提物和纯化物的冻干粉复溶，按照式（1）测定多酚浓度，多酚纯度计算公式如下：

式中，V′为冻干样品复溶后溶液的体积（m L）；A″为冻干样品复溶后1m L溶液的吸光值；M为冻干样品的质量（mg）。

1.2.8 抗氧化活性研究

1.2.8.1 还原Fe3+能力的测定 采用铁氰化钾还原法[8]。取0.5m L样液置于离心管中，依次加入pH 6.6的磷酸缓冲液1.25m L、1%的铁氰化钾溶液1.25m L，于50℃水浴20m in后，迅速冷却，再加入10%三氯乙酸溶液1.25m L，3000r/m in离心10m in，取上清液1.25m L，依次加入蒸馏水1.25m L、0.1%三氯化铁溶液1.25m L，混匀后静置10m in，700nm下测定吸光值A1，以蒸馏水代替样液，测得吸光值A2，还原Fe3+能力的测定公式为：

1.2.8.2 DPPH自由基清除能力测定 参照熊建华的方法并略加修改[9]。配制1.0×10-4mol/L DPPH乙醇溶液，4℃避光保存。取1m L DPPH溶液，加入3m L样液，立即混匀，室温避光30min，于517nm下测得吸光值Ae，无水乙醇替代DPPH测得吸光值Af，无水乙醇替代样液测得吸光值Ac。清除率计算公式为：

2 结果与分析

2.1 不同大孔树脂对多酚的静态吸附、解吸效果

考虑不同极性和型号的大孔树脂对红松松球鳞片多酚的吸附解吸能力不同，本实验选用了9种大孔树脂ADS-7、S-8、NKA-9、NKA-Ⅱ、HPD600、AB-8、X-5、D101和D3520，分别测定了它们对红松松球鳞片多酚的静态吸附量、静态吸附率、静态解吸率和回收率，结果见表1。

表1 孔树脂对红松松球多酚的静态吸附与解吸附性能Table 1 Absorption and desorption capabilities of different macroretieular resins to polyphenols

静态吸附率和静态解吸率可以直接反映出大孔树脂对活性物质的吸附能力和解吸能力，而回收率可以反映出树脂综合性能的大小。由表1可知，9种大孔树脂对红松松球鳞片多酚的吸附和解吸性能各不相同，这是由于每种大孔树脂的极性、比表面积和平均孔径不同，对多酚的吸附解吸强弱就不同。9种大孔树脂对红松松球鳞片多酚的静态吸附量、吸附率大小顺序为：S-8＞NKA-Ⅱ＞ADS-7＞AB-8＞D101＞NKA-9＞X-5（HPD600）＞D3520，解吸率大小顺序为：AB-8＞D101＞HPD600＞NKA-9＞X-5＞D3520＞S-8＞NKA-Ⅱ＞ADS-7。由此可知，9种大孔树脂中，S-8的吸附能力最强，NKA-Ⅱ次之，但二者的解吸能力很弱，这是由于二者对红松松球鳞片多酚的吸附力大，不易于解吸；而AB-8的吸附能力虽然不及S-8、NKA-Ⅱ和ADS-7，但它的解吸能力最强，分别是S-8的2倍、NKA-Ⅱ的2.6倍和ADS-7的3.7倍。综合考虑树脂的吸附和解吸性能，以回收率的高低为判定指标，选用AB-8树脂进行后续实验。

2.2 AB-8树脂的静态吸附动力学曲线

AB-8树脂对红松松球鳞片多酚的吸附率与吸附时间的相关性如图1所示。由图1可以看出，AB-8树脂对红松松球鳞片多酚的吸附率随着时间的延长而逐渐增大，并且初始阶段吸附速度较快，吸附3h基本达到吸附平衡，3h以后，随着时间的延长，吸附率增幅不再明显。实验结果说明AB-8具有快速吸附红松松球鳞片多酚的特点，经过3h即可达到较好的吸附效果。因而后续实验的吸附时间采用3h。

图1 AB-8树脂静态吸附动力学曲线Fig.1 The static adsorption kinetic curve of AB-8 resin

2.3 AB-8树脂纯化红松松球鳞片多酚的研究

2.3.1 上样体积对多酚回收率的影响 上样体积对多酚回收率的影响如图2所示。由图2可知，随着多酚上样体积的增加，多酚的回收率逐渐降低，尤其当上样体积达到24m L时，已发生漏样现象，多酚的回收率明显低于其他各实验组。虽然上样体积小，多酚的回收率高，但其纯化效率较低。所以综合考虑多酚的回收率和纯化效率，上样体积选择20m L，即0.3BV。

图2 上样体积对多酚回收率的影响Fig.2 Effectof loaded amounton recovery rate of polyphenol

2.3.2 上样浓度对多酚回收率的影响 上样浓度对多酚回收率影响的实验结果如图3所示。由图3可知，在上样浓度较低时，随着样品浓度的增加，多酚的回收率逐渐增加，但当样品浓度超过1.5mg/m L后，多酚的回收率又开始逐渐下降。这是因为，对于一定体积的样品溶液来说，浓度的增加意味着溶质与树脂的接触机会的增大，因此会增强树脂对溶质的吸附作用，吸附洗脱的效果也会更好。但样品浓度过高，与之竞争吸附的杂质也相应增多，导致树脂的吸附选择性降低和多酚在树脂内部的扩散能力降低。所以说适宜的样品浓度能够增加树脂的分离效能。综合考虑，多酚上样液浓度选择1.5mg/m L。

图3 多酚浓度对多酚回收率的影响Fig.3 Effectof polyphenol concentration on recovery rate of polyphenol

2.3.3 水洗体积的确定 用蒸馏水淋洗树脂柱能起到很好的除杂作用。水洗时，初始的流出液较浑浊，颜色较深，但从2BV开始，流出液颜色逐渐变浅，当淋洗完3BV蒸馏水后，流出液基本透明，说明大部分杂质已经被去除。所以，水洗体积选择为3BV。

2.3.4 洗脱剂浓度对多酚回收率的影响 由图4可以看出，乙醇浓度对红松松球鳞片多酚的回收率有较大影响。随着乙醇浓度的增大，多酚回收率明显提高。90%乙醇作为洗脱剂的多酚回收率比80%乙醇高了7%，比40%乙醇高了1倍。这说明在实验范围内，90%乙醇对红松松球鳞片多酚的解吸能力最强，因而回收率也最高。所以，选择90%的乙醇作为红松松球鳞片多酚的洗脱剂。

图4 乙醇浓度对多酚回收率的影响Fig.4 Effectof ethanol concentration on recovery rate of polyphenol

2.3.5 洗脱曲线的绘制和洗脱剂体积的确定 在已确定的最佳吸附洗脱条件下，取红松松球鳞片多酚溶液上柱、吸附、洗脱，从醇洗开始，每5m L收集一管，共收集26管，测定每管洗脱液中多酚含量，以收集管数为横坐标，洗脱液中多酚含量（mg/m L）为纵坐标，绘制洗脱曲线，动态洗脱效果如图5所示。从洗脱曲线图5可以看出，开始时，洗脱液中多酚含量随着洗脱体积的增加而增大，当洗脱至第11管时，洗脱液中多酚含量达到最大值，之后随着洗脱体积的增加，多酚含量逐渐下降，当洗脱至21管即洗脱体积为1.6BV左右时，洗脱液中多酚含量已不足0.01mg/m L，从节省洗脱剂用量和洗脱时间方面考虑，洗脱剂的用量选择1.6BV比较适宜。

图5 AB-8大孔树脂洗脱红松松球鳞片多酚曲线Fig.5 Polyphenol dynamic desorption curve of resin AB-8

2.4 AB-8树脂对红松松球鳞片多酚的纯化效果

按照上述实验确定的最佳上柱和洗脱条件，对红松松球鳞片多酚进行纯化，并按照式（6）计算得到纯化前后的多酚纯度分别为12.51%和35.07%。结果表明，AB-8树脂分离纯化红松松球鳞片多酚的效果良好。

2.5 红松松球鳞片多酚纯化前后的抗氧化活性对比

2.5.1 对Fe3+的还原能力 粗提多酚和纯化多酚还原能力的对比如图6所示。由图6可知，在实验的样液浓度范围内，粗提多酚和纯化多酚的还原能力都随样液浓度的增加而明显增大，并且纯化多酚的还原力明显强于粗提多酚。

图6 红松松球鳞片多酚的还原力Fig.6 Reducing power of crude and purified polyphenol from Korean pine cone lamella

2.5.2 对DPPH的清除能力 红松松球鳞片多酚对DPPH自由基的清除效果如图7所示。由图7可知，粗提多酚和纯化多酚对DPPH自由基都有良好的清除效果，并且纯化多酚的清除效果优于粗提多酚。当样液浓度为30μg/m L时，纯化多酚的清除率达到84.85%，以后随着浓度的增加清除率基本不变；而此时粗提多酚的清除率为58.59%。

图7 红松松球鳞片多酚的DPPH自由基清除能力Fig.7 Scavenging effectof crude and purified polyphenol from Korean pine cone lamella on DPPH free radicals

3 结论

3.1 本实验采用静态吸附法，考察了9种不同极性的大孔树脂ADS-7、S-8、NKA-9、NKA-Ⅱ、HPD600、AB-8、X-5、D101、D3520对红松松球鳞片多酚的吸附与解吸能力，以多酚回收率的高低为判定指标，确定了AB-8为最佳吸附树脂。通过AB-8树脂对红松松球鳞片多酚的纯化工艺研究，初步得出了AB-8树脂纯化红松松球鳞片多酚的最佳条件：上样体积为0.3BV，上样浓度为1.5mg/m L，上样后静态吸附3h，水洗3BV，洗脱剂为90%乙醇，洗脱剂用量为1.6BV。纯化后，红松松球鳞片多酚的纯度由12.51%提高到35.07%。

3.2 红松松球鳞片多酚具有很好的还原Fe3+的能力和清除DPPH自由基的能力，通过对比纯化前后的红松松球鳞片多酚的作用效果，可知纯化多酚的作用效果明显优于粗提多酚，这说明红松松球鳞片中的多酚成分对还原Fe3+和清除DPPH起了重要作用，但具体的作用机制和起作用的主要成分有待于进一步研究。

[1]Mara EM Braga，Rosa MS Santos，Inês JSeabra.Fractioned SFE of antioxidants from maritime pine bark[J].Journal of Supercritical Fluids，2008，47：37-48.

[2]M Pinelo，M Rubilar，JSineiro，et al.Extraction of antioxidant phenolics from almond hulls（Prunus amygdalus）and pine sawdust（Pinus pinaster）[J].Food Chemistry，2004，85：267-273.

[3]Anna Sokoł-Łe towska，Jan Oszmianski，Aneta Wojdyło. Antioxidantactivity of the phenolic compounds of hawthorn，pine and skullcap[J].Food Chemistry，2007，103：853-859.

[4]Satu Turtola，Leena Sallas，Jarmo K.Holopainen.Long-term exposure to enhanced UV-B radiation has no significant effects on growth or secondary compounds of outdoor-grown Scots pine and Norway spruce seedlings[J].Environmental Pollution，2006，144：166-171.

[5]AM Freitas，MTR Almeida，CR Andrighetti-Fröhner，et al. Antiviral activity-guided fractionation from Araucaria angustifolia leaves extract[J].Journal of Ethnopharmacology，2009，126：512-517.

[6]李文仙，俞丹，林玲，等.Folin-Ciocalteu比色法应用于蔬菜和水果总多酚含量测定的研究[J].营养学报，2011，33（3）：302－307.

[7]水明磊，籍保平，李博，等.大孔树脂对苹果渣中多酚与果胶分离的研究[J].食品科学，2007，28（12）：50-55.

[8]回晶，李其久，孟宪焘.土槿皮多糖的体外抗氧化作用研究[J].辽宁大学学报：自然科学版，2008，35（2）：155-157.

[9]熊建华.巴拉圭茶多酚的分离纯化及功能研究[D].长沙：湖南农业大学，2007：74.

Purification technology of polyphenol from Korean pine cone lamella
w ith macroporous resins and research of their antioxidant ability

LIBo1，2，BAO Yi-hong1，GAO Feng3，WANG Zhen-yu1，*
（1.College of Forestry，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China；
2.Departmentof Scientific Research Management，Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences，Harbin 150086，China；
3.Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences，Harbin 150086，China）

Accord ing to adsorp tion and desorp tion p roperty of macroporous resins to polyphenol，an op timal macroporous resin was chosen from ADS-7、S-8、NKA-9、NKA-Ⅱ、HPD600、AB-8、X-5、D101、D3520 resins for purifying polyphenol from Korean p ine cone lamella.AB-8 was found to be the most app rop riate resin.The purification of polyphenolwas stud ied，op timum cond itions were as follows：the loaded amount was 0.3BV，the concentration of polyphenolwas 1.5mg/m L，the time static absorp tion was 3h，the volume of elution water was 3BV，the eluting solventwas 90%alcohol，the volume of alcoholwas 1.6BV.Under these conditions，the purity of polyphenol was 12.51%in the purified sam p les，while it was 35.07%in the c rude sam p les.In add ition，the comparative study on the antioxidant ability was performed between c rude and purified samp les.The result showed that Fe3+reducing power and the scavenging ac tivity on DPPH radical were enhanced after the samp les were purified.

macroporous resins；purification；Korean pine cone lamella；polyphenol；antioxidantability

TS201.1

B

1002-0306（2012）22-0251-05

2012－08－14 *通讯联系人

李波（1980-），男，在读博士，助研，研究方向：植物活性成分的分离与开发。

国家自然科学基金（31170510）。