李彦杰，肖国生，刘仁华，杨俊年

（1.重庆三峡学院生命科学与工程学院，重庆 404000；

2.三峡库区可持续发展研究中心，重庆 404000）

重组人基质金属蛋白酶2（MMP-2）血红素样蛋白表达优化

李彦杰1，2，肖国生1，刘仁华1，杨俊年1

（1.重庆三峡学院生命科学与工程学院，重庆 404000；

2.三峡库区可持续发展研究中心，重庆 404000）

为确定重组大肠杆菌（BL21（DE3）/PET42a-PEX）最佳表达条件。在单因素实验的基础之上，以目的蛋白PEX表达量为响应值，应用Box-Behnken中心组合设计建立数学模型，进行响应面分析。响应面分析确定的最优因素水平组合为：LB培养基pH为7.50，诱导时菌液OD600为0.60，IPTG诱导浓度为0.60mmol/L，诱导培养时间为5.0h。对此工艺条件进行验证得到目的蛋白PEX表达量为20.98mg/L。结果显示，优化了基因重组大肠杆菌表达人PEX的条件，为实现基因重组原核工程菌发酵法制备重组PEX奠定了基础。

大肠杆菌，基质金属蛋白酶2，血红素样蛋白，Box-Behnken设计

基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinase，MMPs）是一组Zn2+依赖性内源性蛋白水解酶超家族，在降解包括骨在内的全身各种组织细胞外基质（extracellular matrix，ECM）过程中扮演着重要角色[1-3]。MMP-2是该家族的重要一员，主要由成纤维细胞、角质形成细胞、内皮细胞、软骨细胞、成骨细胞和单核细胞等多种细胞分泌合成[3-5]。MMP-2参与降解IV型胶原蛋白，I型胶原蛋白和细胞外糖蛋白，在肿瘤侵袭转移中起关键作用[3，6]。基质金属蛋白酶（MMPs）血红素样蛋白（matrixmetalloproteinase 2 hemopexin-like C-terminal domain，PEX）是除MMP-7、MMP-23和MMP-26外所有MMPs在羧基端共有的结构域，体内提取的PEX是MMPs的内源性抑制剂[7-10]。研究发现MMP-2-PEX能抑制MMP-2对ECM的降解、血管的形成、细胞的迁移和增殖[11-15]。提取人神经胶质瘤U87细胞总RNA，RTPCR克隆人基质金属蛋白酶2（MMP-2）血红素样蛋白的cDNA序列PEX，构建原核表达载体PET42a-PEX，转化大肠杆菌BL21（DE3），异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）诱导后显示目的蛋白为可溶性表达[16]。本文采用Box-Behnken设计（Box-Behnken design，BBD）的响应面法（response surface methodology，RSM）优化重组人PEX的可溶性表达条件，为实现基因重组原核工程菌发酵法制备重组PEX奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

重组大肠杆菌（BL21（DE3）/PET42a-PEX） 本实验室保存。

M ini-proteantetra小型垂直电泳槽 美国Bio-rad公司；GelDoc XR凝胶成像仪 配有Quantity One分析软件，美国Bio-rad公司；5418型高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；S20K型pH计 瑞士Mettler-Toledo公司；Biophotometer Plus生物分光光度计 德国Eppendorf公司。

1.2 实验方法

1.2.1 种子培养 重组大肠杆菌（BL21（DE3）/PET42a-PEX）涂布到含有100mg/L AMP的LB平板上倒置过夜，挑取鉴定正确的单克隆接种到100m L含100mg/L AMP的LB液体培养基中，37℃和220r/m in振荡培养过夜，然后按5‰接入500m L含100mg/L AMP的LB液体培养基中继续培养，分别收集OD600值为0.20、0.40、0.60、0.80和1.00的菌液10m L备用。

1.2.2 单因素实验设计 以目的蛋白PEX表达量为评价指标，研究不同LB培养基pH、诱导时菌液OD600值、IPTG诱导浓度和诱导培养时间对目的蛋白表达量的影响。

1.2.3 目的蛋白表达量分析 裂解单因素诱导表达后细菌培养物，10000r/m in离心10m in，取上清液进行SDS-PAGE，Bio-Rad Gel Doc XR凝胶成像仪扫描电泳胶，用Quantity One 4.4.0软件分析计算目的蛋白表达量。

1.2.4 响应面的组合实验 根据单因素的实验结果，利用Design-Expert 8.0软件进行BBD实验设计，优化PEX可溶性表达工艺。根据单因素分析结果，以LB培养基pH（X1），诱导时菌液OD600（X2），IPTG诱导浓度（X3）和诱导培养时间（X4）进行4因素3水平Box-Behnken实验设计。以-1、0、1代表自变量水平，实验因素及水平编码如表1所示。

表1 实验因素和水平编码表Table 1 Coding of levels and factors chosen for the trials

2 结果与分析

2.1 目的蛋白表达的单因素分析

图1 LB培养基pH对PEX表达的影响Fig.1 Effectof pH in LB on expression of PEX

2.1.1 LB培养基pH对目的蛋白表达的影响 固定诱导时菌液OD600为0.40，IPTG浓度为0.40mmol/L，诱导时间3.0h，LB培养基pH分别设定为6.00、6.50、 7.00、7.50、8.00，结果见图1。由图1可知，随着pH由6.00增高至7.00，目的蛋白表达量逐步上升，并在pH在7.00达到最大值，这是因为大肠杆菌在发酵中产酸会使培养基pH下降，而培养基pH下降后会抑制大肠杆菌的生长繁殖。当pH大于7.50，目的蛋白表达量开始下降。故选择LB培养基pH为7.0。

2.1.2 诱导时菌液OD600对目的蛋白表达的影响 固定诱导时LB培养基pH为7.00，IPTG浓度为0.40mmol/L，诱导时间3.0h，诱导时菌液OD600值分别设定为0.20、0.40、0.60、0.80、1.00，结果见图2。由图2可知，OD600为0.20时，目的蛋白表达量很低，这是因为此时培养液中重组工程菌绝对数量较小所致。随着OD600上升，目的蛋白表达量逐步上升，并在OD600为0.60时表达量最高。OD600大于0.60，目的蛋白表达量下降，这可能与因为菌液OD600过大时，菌液中活菌数绝对数量下降有关。故选择诱导时菌液OD600为0.60。

图2 菌液OD600对PEX表达的影响Fig.2 Effectof bacterial liquid OD600 on expression of PEX

2.1.3 IPTG诱导浓度对目的蛋白表达的影响 固定诱导时LB培养基pH为7.00，OD600为0.60，诱导时间3.0h，IPTG诱导浓度分别设定为0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mmol/L，结果见图3。由图3可知，随着IPTG诱导浓度由0.20mmol/L增高至0.60mmol/L，目的蛋白表达量逐步增加至最高。IPTG诱导浓度由0.60mmol/L增高至0.80mmol/L，目的蛋白表达量缓慢降低。这可能是因为高浓度IPTG的细胞毒性作用抑制了宿主菌的生长繁殖。故IPTG诱导浓度选择0.60mmol/L。

图3 IPTG诱导浓度对PEX表达的影响Fig.3 Effect of induce concentration of IPTG on expression of PEX

2.1.4 诱导培养时间对目的蛋白表达的影响 固定固定诱导时LB培养基pH为7.00，OD600为0.60，IPTG诱导浓度为0.60，诱导培养时间分别设定为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0h，结果见图4。由图4可知，诱导培养2.0、3.0h时，目的蛋白表达量较低。诱导培养4.0h时，目的蛋白表达量最高，随着诱导培养时间增加，目的蛋白表达量缓慢降低。故选择诱导培养时间为4.0h。

图4 诱导培养时间对PEX表达的影响Fig.4 Effectof induce time on expression of PEX

2.2 响应面的实验设计与结果分析

2.2.1 实验设计方案与结果分析 实验设计方案及结果见表2。

表2 Box-Behnken实验设计方案及结果Table 2 Design of Box-Behnken experiment

利用Design-Expert 8.0软件对表2中的实验数据进行回归分析，拟合回归模型为二次方程：Y=18.81+ 4.86X1+0.14X2+0.34X3+3.20X4+0.17X1X2+0.34X1X3+ 2.13X1X4-0.91X2X3+0.087X2X4-0.27X3X4-6.82X12-0.77X22-0.94X32-2.77X42。回归模型显著性检验结果见表3。

由表3可知，回归模型极显著（p＜0.01）。模型及一次项X1、X4，二次项X12、X42和交互项X1X4极显著（p＜ 0.01），模型中其余项均不显著（p＞0.05），表明各因素对目的蛋白的表达量不是简单的线性关系。计算拟合模型的判定系数R2=0.9763，校正判定系数RAdj2= 0.9527，预测判定系数RPred2=0.8720，且失拟项不显著（p＞0.05），表明模型拟合程度比较好，可以用此模型对目的蛋白PEX表达量进行分析、预测和确定最佳表达工艺条件。

表3 回归模型显著性检验Table 3 Test for significance of regressionmodel

2.2.2 回归模型的验证实验 利用Design-Expert 8.0数据分析软件，由模型的二次方程计算得4个因素最优值为：LB培养基pH为7.48，诱导时菌液OD600为0.63，IPTG诱导浓度为0.62mmol/L，诱导培养时间为4.8h。在此组合下响应值Y在实验区域内可达最优点，即重组人PEX表达量最大，理论值为21.21mg/L。为验证上述优化结果，按照确定的最优条件，实际取LB培养基pH为7.50，诱导时菌液OD600为0.60，IPTG诱导浓度为0.60mmol/L，诱导培养时间为5.0h进行发酵表达，重复实验3次，重组人PEX的实测平均值为20.98mg/L，与模型的预测值较为接近，进一步说明此回归模型的拟合程度较好。

3 结论

外源基因在大肠杆菌表达系统中的高效表达，除受表达系统的启动子、终止子、核糖体结合位点和密码子偏爱性等影响之外，还受如培养温度、培养基pH、IPTG诱导浓度、诱导表达时间、诱导时菌液OD600值和培养基营养成分等外界环境因素的影响。因此选择合适的诱导培养条件，可有效提高目的基因的表达量，从而降低实验成本，提高表达效率。

响应面分析通过研究实验指标与多个实验因素间的回归关系建立回归方程，然后求解最优值。响应面实验设计分析要求实验因素已在最优值范围附近，因此本研究首先通过单因素实验选定了参与响应面实验的LB培养基pH、诱导时菌液OD600、IPTG诱导浓度和诱导培养时间4个因素，并设立不同水平，然后应用响应面分析法建立了目的蛋白表达量的二次多项数学模型，并通过手动优化模型。通过对优化后模型方程求解，得到最佳的工艺条件是：LB培养基pH为7.50，诱导时菌液OD600为0.60，IPTG诱导浓度为0.60mmol/L，诱导培养时间为5.0h。此条件下目的蛋白表达量为20.98mg/L。验证实验PEX表达量接近最大预测值，显示拟合模型对于基因重组原核工程菌发酵法制备重组PEX具有实践意义。

[1]Brigitte B.New facets of matrix metalloproteinases MMP-2 and MMP-9 as cell surface transducers：Outside-in signaling and relationship to tumor progression[J].Reviews on Cancer，2012，1825（1）：29-36.

[2]Visser，NagaseH.Matrixmetalloproteinasesand tissue inhibitors of metalloproteinases：structure，function and biochemistry[J]. Circulation Research，2003，92（8）：827-839.

[3]AmǎlineiC，Cǎruntu D，Bǎlan RA.Biology ofmetalloproteinases [J].Romanian Journal of Morphology and Embryology，2007，48（4）：323-334.

[4]Jezierska A，Motyl T.Matrixmetalloproteinase-2 involvement in breast cancer progression：amini-review[J].Medical Science Monitor，2009，15（2）：32-40.

[5]Homas P，Lozito，Rocky ST.Endothelial cell microparticles actas centers ofmatrixmetalloproteinsase-2（MMP-2）activation and vascularmatrix remodeling[J].Journalof Cellular Physiology，2012，227：534-549.

[6]Elizabeth F，Amato J，Giaccia.Hypoxia，inflammation，and the tumor microenvironment in metastatic disease[J].Cancer and Metastasis Reviews，2010，29（2）：285-293.

[7]Zucker S，Cao J.Selective matrix metalloproteinase（MMP）inhibitors in cancer therapy[J].Cancer Biology and Therapy， 2009，24（8）：2371-2373.

[8]Dimitra B，William G，Stetler S.Matrix metalloproteinases（MMPs）and tissue inhibitors of metalloproteinases（TIMPs）：Positive and negative regulators in tumor celladhesion[J].Seminars in Cancer Biology，2010，20（3）：161-168.

[9]Janelle LF，Michael J，Chalmers SA，et al.Identification of specific hemopexin-like domain residues that facilitate matrix metalloproteinase collagenolytic activity[J].The Journal of Biological Chemistry，2009，284（36）：24017-24024.

[10]KaiK，VickiP，ZenaW.Matrixmetalloproteinases：regulators of the tumormicroenvironment[J].Cell，2010，141（1）：52-67.

[11]Xua XP，Mikhailovaa M，Chena ZH，et al.Peptide from the C-terminal domain of tissue inhibitor of matrix metalloproteinases-2（TIMP-2）inhibitsmembrane activation of matrix metalloproteinase-2 （MMP-2）[J].Matrix Biology，2011，30（7）：404-412.

[12]Ravesanker E，Unmesh J，Indra M，et al.The hemopexin domain of MMP-9 inhibits angiogenesis and retards the growth of intracranialglioblastoma xenograft in nudemice[J].Cancer Cell Biology，2009，124（2）：306-315.

[13]Alireza SA，David AC.Integrins in angiogenesis[J]. ANGIOGENESIS，2008（1）：63-73.

[14]Bello L，Lucini V，Carrabba G，et al.Simultaneous inhibition of glioma angiogenesis，cell proliferation and invasion by a naturally occurring fragment of human metalloproteinase-2[J]. Cancer Research，2001，61（24）：8730-8736.

[15]Ezhilarasan R，Jadhav U，Mohanam I，et al.The hemopexindomain of MMP-9 inhibits angiogenesis and retards the growth of intracranial glioblastoma xenograft in nudemice[J]. Cancer，2009，124：306-315.

[16]李彦杰，杨俊年，王保莉，等.人基质金属蛋白酶2（MMP-2）类血红素结构域克隆及原核表达[J].西北农业科学，2007，16（6）：94-96.

Optim ization of expression conditions of recombinant human-source matrix metalloproteinase 2 hemopexin-like C-term inal domain

LIYan-Jie1，2，XIAO Guo-sheng1，LIU Ren-hua1，YANG Jun-nian1
（1.College of Life Science and Engineering，Chongqing Three Gorges University，Chongqing 404000，China；
2.Research Centre for Sustainable Development，Three Gorges Reservoir Region，Chongqing 404000，China）

To op tim ize fermentation cond itions of Genetically Engineered Escherichia coli（BL21（DE3）/PET42a-PEX），Box-Behnken design was used to estab lish mathematical model based on sing le-factor tests.The response surface methodology（RSM）analysis result showed that the op timal scale of fac tors was：Luria-Bertani liquid culture medium pH7.50，bac terial liquid op tical density（OD600）0.60，induce concentration of IPTG 0.60mmol/L，induce time 5.0h.Under these op tim ized cond itions，the yield of PEX was 20.98mg/L.Op tim ization of exp ression cond itions of genetically engineered Escherichia coli exp ressing recombinant human-source matrixmetallop roteinase 2 hemopexin-like C-term inaldomain was studied，and laid the foundation of generation of human recombinant PEX by fermentation.

Escherichia coli；matrixmetallop roteinase 2；hemopexin-like C-term inaldomain；Box-Behnken design

Q815

A

1002-0306（2012）20-0248-04

2012－04－28

李彦杰（1979-），男，硕士，讲师，研究方向：生物技术。

教育部科学技术研究重点项目（211150）；重庆三峡学院项目（2008-sxxyqn-31）。