温拥军，游玟娟，罗跃中，谢达平

（1.湖南化工职业技术学院，湖南株洲 412004；

2.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙 410128）

赤藓糖醇高产菌选育及发酵条件研究

温拥军1，2，游玟娟1，罗跃中1，谢达平2

（1.湖南化工职业技术学院，湖南株洲 412004；

2.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙 410128）

为了提高赤藓糖醇的产量，对自选耐高渗酵母菌T-3-2进行紫外线与亚硝酸复合诱变处理，并采用响应曲面法优化了其发酵条件。复合诱变得到1株稳定高产突变株UN-11，其赤藓糖醇的产量达到78.3mg/mL，比T-3-2提高了38.8%；通过响应面分析建立了关键影响赤藓糖醇产量的二次多项式数学模型，得到最佳生产工艺条件为：发酵温度31℃、转速170r/min、接种量9.8%。模型预测结果产物浓度达到84.93mg/mL，验证实验结果产物浓度为85.25mg/mL。该模型对赤藓糖醇工业化生产有一定的指导意义。

赤藓糖醇，耐高渗酵母，紫外线，复合诱变，响应曲面法

赤藓糖醇是一种国际上较为流行的新型甜味剂，它主要存在于藻类、蘑菇等真菌类生物，甜瓜、葡萄等水果以及葡萄酒、酱油等各类发酵食品中，同时它在人体的血液、精液、尿液中也有一定的含量[1-3]。其具有低热值、口感好、低吸湿性、无致龋齿性、不易出现变褐现象等优点[4-6]。因此在食品工业，医药保健及化妆品等行业均有广阔的应用前景[7]，但长期以来赤藓糖醇行业受困于成本高、价格昂贵，严重限制其应用范围。目前，赤藓糖醇的工业化生产唯一方法是微生物发酵法，在微生物发酵生产中影响产物产量的主要因素是菌种和发酵条件。近年来，国内外学者对此进行了大量研究，刘鹏等[8]筛选得到一株赤藓糖醇产生菌E54，其产量为41.1g/L；刘凤珠等[9]通过紫外诱变获得一株产赤藓糖突变C1，其产量为24.9g/L；董海洲等[10]对Torulopsis sp.ERY237发酵条件进行优化，在最佳条件下赤藓糖醇产量可达87.8g/L。总的来说，我国对赤藓糖醇生产的研究系统化程度低，产量不高，工业化进程较慢。如何进一步提高菌种性能，优化发酵条件，提高赤藓糖醇产量，将是今后研究的重点。本研究以自选耐高渗酵母（osmotolerant yeast T-3-2）为出发菌株，经紫外线与亚硝酸复合诱变，得到一株稳定高产突变株UN-11，通过对发酵条件进行优化，使赤藓糖醇的产量大幅度提高，旨在通过降低生产成本，提高其市场竞争力，扩大其应用范围。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

耐高渗酵母（osmotolerant yeast T-3-2） 由本实验组从蜂巢中分离得到；斜面培养基 PDA培养基；固体平板培养基 葡萄糖50%，酵母膏0.5%，琼脂2%，pH6.0；发酵培养基 葡萄糖30%，玉米浆0.8%，CuSO4·5H2O 0.05%，MnSO4·4H2O 0.5%，pH自然。

HPS-250生化培养箱 哈尔滨东明医疗仪器厂；CBV-1500A超净工作台 上海瑞仰净化装备有限公司；QYC.2102摇床 上海福玛实验设备有限公司，LDZ4-0.8A离心机 北京医用离心机厂；HH.SYHNi2-C水浴锅 北京长源实验设备厂；UV-9100紫外可见分光光度计 北京瑞利分析仪器公司。

1.2 实验方法

1.2.1 紫外及亚硝酸诱变方法 参照游玟娟等[11]实验方法进行，诱变菌株经培养后，挑取菌落较大且厚的菌株，编号并接入试管斜面保藏，同时取对应的菌株接种到250m L摇瓶（装液量为50m L）中，置于30℃，180r/m in摇床培养5d，测定发酵液的赤藓糖醇含量。

1.2.2 发酵条件优化方法 采用单因素实验，分别研究发酵温度、发酵时间、摇床转速、接种量、装液量及起始pH对菌株UN-11赤藓糖醇产量的影响。在此基础上，运用Box-Behnken设计进行响应曲面优化，找到最佳发酵条件。BBD实验设计的因素及水平如表1所示。

表1 BBD响应面设计的因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.2.3 赤藓糖醇测定方法 采用袁野等[12]高碘酸氧化法测定。

2 结果与分析

2.1 紫外线诱变筛选结果

紫外线诱变得到结果如表2所示。由表2可知，经过紫外线诱变后，部分菌株赤藓糖醇产量下降，如UV-2、UV-6、UV-16、UV-20等，同时也发现大部分菌株的赤藓糖醇产量都有所提升，如UV-9、UV-11、UV-13、UV-14、UV-17、UV-19菌株产量都达到了60mg/m L以上，其中UV-13菌株赤藓糖醇产量最高，达到68.4mg/m L。相对于出发菌株T-3-2，UV-13产赤藓糖醇的能力提高了21.3%。

表2 紫外线诱变后菌株的赤藓糖醇产量Table 2 Erythritol yield after UV mutagenesis

2.2 亚硝酸诱变筛选结果

对菌株UV-13再进行亚硝酸诱变处理，得到结果如表3。由表3可知，经亚硝酸诱变后，赤藓糖醇的产量进一步提高，紫外线与亚硝酸有较好的协同性。绝大部分菌株赤藓糖醇产量是提高的，其中菌株UN-11赤藓糖醇产量的为78.3mg/m L，相对于UV-13提高了11.4%，即为本实验得到的目的菌株。

表3 亚硝酸诱变后菌株的赤藓糖醇产量Table 3 Erythritol yield after nitritemutagenesis

2.3 单因素实验结果

2.3.1 发酵温度对菌株UN-11赤藓糖醇产量的影响

发酵温度对菌株UN-11赤藓糖醇产量的影响如图1所示。由图1可知，温度对赤藓糖醇产量有显著影响。当温度低于30℃时，赤藓糖醇产量随温度升高而逐渐增加；温度超过30℃时，随温度升高赤藓糖醇产量反而降低；当发酵温度为30℃，赤藓糖醇产量最高，达到81.4mg/m L。其原因是温度会影响酵母菌的生长，温度过低则酵母细胞生长过慢，温度过高则细胞生长旺盛，影响了产物的积累；而且温度过高，会增加能耗，从工艺角度看会增加生产成本，所以，发酵温度宜选30℃。

图1 发酵温度对菌株UN-11赤藓糖醇产量的影响Fig.1 Effectof temperature on erythritol yield of UN-11

2.3.2 发酵时间对菌株UN-11赤藓糖醇产量的影响按实验方法测得不同发酵时间对赤藓糖醇产量的影响如图2所示。由图2可知，发酵时间在96～192h内，随着时间的延长，赤藓糖醇产量增加，但超过144h后，增速减缓。原因是赤藓糖醇在细胞内合成途径复杂，其合成与生长速度不一致，有明显的“滞后性”。从工艺角度上讲，发酵时间选144h为较好。

2.3.3 转速对菌株UN-11赤藓糖醇产量的影响 不同转速对赤藓糖醇产量的影响，结果如图3所示。

图2 发酵时间对菌株UN-11赤藓糖醇产量的影响Fig.2 Effectof time on erythritol yield of UN-11

图3 转速对菌株UN-11赤藓糖醇产量的影响Fig.3 Effectof revolution on erythritol yield of UN-11

由图3可以看出，转速对赤藓糖醇产量影响显著。当转速180r/m in时，赤藓糖醇产量最高，为81.5mg/m L。由于酵母菌合成赤藓糖醇是好氧过程，转速主要影响发酵液的溶氧量，在120～180r/min内，增加转速则溶氧量增加，有利于酵母的生长。但转速过快，会产生过大的剪切力，损伤细胞而导致产量下降。因此，确定最佳转速为180r/m in。

2.3.4 接种量对菌株UN-11赤藓糖醇产量的影响 从图4可知，接种量对赤藓糖醇产量有显著影响。当接种量＜10%的范围内，接种量与赤藓糖醇产量呈正相关。接种量＞10%后，则随接种量增加，产量反而下降。可能是因为过大的接种量会使得发酵前期菌体生长过旺，导致繁殖代数偏少，使得老化细胞所占比例增大，影响赤藓糖醇在细胞中的积累。在工艺角度来看，适当增加接种量，能缩短生产周期，但接种量过大则会增加制备种子液的成本，并引起产量下降。因此宜选接种量为10%。

图4 接种量对菌株UN-11赤藓糖醇产量的影响Fig.4 Effectof inoculum concentration on erythritol yield of UN-11

2.3.5 装液量对菌株UN-11赤藓糖醇产量的影响 不同装液量对菌株UN-11赤藓糖醇产量的影响如图5所示。

图5 装液量对菌株UN-11赤藓糖醇产量的影响Fig.5 Effectof medium volume on erythritol yield of UN-11

装液量主要影响的也是发酵的溶氧量，由图5可知，随着装液量的增多，单位体积赤藓糖醇的产量越来越少，但赤藓糖醇的总产量则是随着装液量的增加，先升高后降低，当装液量为100m L时，总产量达到8020mg/瓶，为最大值。因此，装液量宜选100m L。

2.3.6 起始pH对菌株UN-11赤藓糖醇产量的影响不同起始pH对菌株UN-11赤藓糖醇产量的影响如图6所示。由图6可以看出，起始pH对菌株UN-11赤藓糖醇产量影响不显著，当起始pH处于4～7范围内时，赤藓糖醇的产量较高，当起始pH等于6时，赤藓糖醇产量为82.9mg/m L，达到最大值。在起始pH为8赤藓糖醇的产量最低，为78.4mg/m L。产生这种结果的原因是真菌最适pH为弱酸性，当超过这个范围时，菌体生长受到影响，甚至不能生长，故起始pH应选择6。

图6 起始pH对菌株UN-11赤藓糖醇产量的影响Fig.6 Effectof pH value on erythritol yield of UN-11

2.4 Box-Behnken设计与结果

在单因素实验的基础上，选取对赤藓糖醇产量影响较显著的3个因素作为考察对象，即温度（X1）、转速（X2）、接种量（X3）。其他因素控制在各自最佳水平。根据Box-Behnken设计的原理，利用M initab软件设计一个3因素3水平共15个实验点的实验设计，所得结果如表4所示。

以赤藓糖醇产量为响应值，用Minitab 15.0软件对实验结果进行多元回归分析，所得结果如表5、表6所示。结果表明，模型在α=0.05水平上回归显著；失拟项p=0.157＞0.1，失拟不显著。同时，一次项、平方项以及X2X3项均对响应值有显著性影响。X1X2、X1X3交互项作用影响不显著。

借助软件中的回归拟合，实验因子X对响应值Y的影响可用回归方程表示为：赤藓糖醇产量Y= 84.23+3.71X1-1.9X2+1.71X3-6.29X12-2.37X22+4.49X32-2.18X2X3；决定系数R2为91.15%，模型拟合程度较好。求解得到最佳条件为发酵温度X1=30.59℃、转速X2=169.5r/min、接种量X3=9.78%，模型预测结果为84.93mg/m L。考虑到操作可行，将最佳条件修约为发酵温度X1=31℃、转速X2=170r/m in、接种量X3=9.8%。在此条件下进行验证，赤藓糖醇的产量为85.25mg/m L，与预测结果基本吻合。说明该模型对赤藓糖醇发酵生产有理论指导意义。转速（X2）与接种量（X3）的三维响应面图见图7。由图7可以知，当接种量控制在10.7%时，转速在150～163.2r/m in范围内，赤藓糖醇的产量随转速的增大而增加。继续增大转速则产量反而下降。当转速固定在163.2r/m in时，接种量对产量的影响也存在最大值，当接种量为10.7%，赤藓糖醇的产量达到85.03mg/m L。

表4 BBD实验设计及实验结果Table 4 Box-Behnken design and experimental results

表5 模型的回归分析Table 5 Regression analysis ofmodel

表6 模型的方差分析Table 6 Variance analysis ofmodel

图7 Y=f（X2，X3）响应面立体分析图Fig.7 3D analysis charta of y=f（X2，X3）

3 结论

采用紫外线与亚硝酸复合处理，通过筛选得到一株稳定高产突变株UN-11，其赤藓糖醇的产量达到78.3mg/m L，比T-3-2提高了38.8%。对高产突变株UN-11的发酵条件进行了优化，运用Box-Behnken响应面技术建立了关键影响赤藓糖醇产量的二次多项式数学模型：Y=84.23+3.71X1-1.9X2+1.71X3-6.29X12-2.37X22+4.49X32-2.18X2X3。得到最佳提取工艺为：发酵温度X1=31℃、转速X2=170r/m in、接种量X3=9.8%。模型预测结果产物浓度为84.93mg/m L，验证实验结果产物浓度达到85.25mg/m L。

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Study on breeding of high erythritol producing strain and fermentation condition

WEN Yong-jun1，2，YOUWen-juan1，LUO Yue-zhong1，XIE Da-ping2
（1.Hunan Chemical Industry Vocational Technology College，Zhuzhou 412004；
2.College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128）

In order to im p rove the yield of erythritol，the original strain osmotolerant yeast T-3-2 was treated by UV and HNO2，and its fermentation cond ition was op tim ized by sing le factor and response surface methodology（RSM）.A high and stab le yield mutant named UN-11 was ob tained.The erythritol yield of UN-11 was 78.3mg/m L，which increased 38.8%com pared w ith the original strain.The second-order polynom ial equation for erythritol yield was estab lished by response surface analysis theory.Op tim ized p rocessing cond itions obtained were fermentation tem perature of 31℃，rotate speed of 170r/m in and inoculation amount of 9.8%（v/v）. Under these op tim ized conditions，the p redic ted yield of fitted modelwas 84.93mg/m L and verifying test result was 85.25mg/m L.The modelhad some guid ing sense for erythritol industrialp roduction.

erythritol；Osmotolerant yeast；UV；com pound mutagenesis；response surface methodology（RSM）

TS201.3

A

1002-0306（2012）22-0242-04

2012－05－21

温拥军（1980－），男，硕士，讲师，研究方向：微生物工程。