赵小元，文鹏程，艾对元，杨 敏，梁 琪，米 兰，张 炎，张卫兵

（甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州 730070）

藏灵菇增殖条件的优化

赵小元，文鹏程，艾对元，杨 敏，梁 琪，米 兰，张 炎，张卫兵*

（甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州 730070）

采用单因素实验、部分因素实验和中心组合设计对藏灵菇在复合培养基中的增殖条件进行优化。结果表明，培养温度和初始接种量对藏灵菇增殖的影响显著，得到的最优条件为：接种量1.1%、温度23.2℃、初始pH6.48、培养时间22h时下，增殖率的预测极大值为263.04%。验证实验表明，在该条件下藏灵菇增殖率为252.67%±4.54%。

藏灵菇，增殖，优化

藏灵菇是一种白色或浅黄色的胶质状物质，外形无规则，多为米粒、花椰菜和薄皮状。藏灵菇常常被误认为是源自亚洲的红茶菌和开菲尔粒，但它们在产品、菌相以及形态学结构上有一定差别[1-2]。具有活性的藏灵菇和开菲尔粒一样可以在乳中生长繁殖，经过长期培养，菇体会逐渐增大。藏灵菇是乳酸菌、醋酸菌和酵母菌等的共生体，菇体含有水、粘性多糖、蛋白质、脂质等[3-5]。藏灵菇发酵乳与普通发酵乳相比，含有更加丰富的蛋白质、L（+）乳酸和B族维生素，同时藏灵菇中的益生菌对白色念珠菌、索氏志贺菌、伤寒沙门氏菌等病原微生物具有强烈的抑制作用。长期食用藏灵菇发酵乳可调节人体胃肠道中的菌群平衡，促进食物的消化吸收、增强人体免疫力，此外还具有抗肿瘤、抗氧化、降血脂、降血压、抗疲劳等多种生物学功效[6-7]。藏灵菇是具有复杂菌相的共生体，利用人工方法对藏灵菇中的菌种进行复配的发酵剂制作的发酵乳很难达到天然藏灵菇酸乳的生理功效。目前，最常用的发酵方法仍是在乳中直接投放藏灵菇菇体或用其制作的种子液制成直投式冻干菌粉进行发酵[8-9]，由于藏灵菇菇体在纯牛奶培养基中增殖速度缓慢，严重制约了藏灵菇发酵乳的大规模工业化生产，而通过在培养基中添加营养物质，可以促进藏灵菇的快速增殖，同时培养基的更换时间、培养温度、菇体的冲洗条件以及基本营养物浓度等因素都有可能影响藏灵菇的增殖[10-12]。前期实验发现，藏灵菇在人工配制的复合培养基中增殖率与纯牛奶培养基中相比有明显增高[13]。本实验通过对藏灵菇在复合培养基中增殖条件的研究为藏灵菇发酵乳的大规模工业化生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

藏灵菇（3号） 收集于甘肃甘南牧区一牧民家中（甘肃省功能乳品工程实验室保藏）；番茄 用料理机磨碎，在5000r/m in条件下离心5m in，上清液即为番茄汁；胡萝卜 用擦丝器擦成细小的薄片，与蒸馏水按1∶1的比例加入料理机中磨碎，在10000r/min条件下离心7m in，上清液即为胡萝卜汁；黄豆粉 按12%的比例加入牛奶中，在40℃水浴条件下搅拌使豆粉完全溶解，过滤得到豆奶；复合培养基 培养基由番茄汁、胡萝卜汁和豆奶按3∶10∶12的比例配制而成[13]，115℃灭菌15m in；牛乳培养基 新鲜牛乳，115℃下灭菌15m in；柠檬酸 天津市光复科技发展有限公司，分析纯；氢氧化钠 天津市滨海科迪化学试剂有限公司，分析纯。

YX-280 A高压灭菌锅 合肥华泰医疗设备有限公司；SUPRA 22K超速真空离心机 韩国Inchun公司；PHS-3C数显酸度计 雷磁分析仪器厂；DHP-9162电热恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；JYL-A010九阳料理机 九阳股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 藏灵菇的活化 将低温保藏的藏灵菇在30℃恒温水浴锅中解冻1h，过滤后用无菌水冲洗菇体，按5%（w/v）的接种量接入灭菌全脂乳培养基中，25℃条件下培养24h，用金属网过滤，再次投入相同体积灭菌全脂乳培养基中，相同步骤活化6次[14-15]。

1.2.2 藏灵菇增殖率的测定 藏灵菇培养过程中滤出藏灵菇不进行冲洗，培养完成后用无菌水洗净，用无菌滤纸吸干粘附在表面的水分后称重，用下式计算藏灵菇的增殖率：

式中：Z为藏灵菇增殖率（%）；M为培养后藏灵菇的质量（g）；m为初次接种时藏灵菇的质量（g）。

1.2.3 培养条件对藏灵菇增殖的影响

1.2.3.1 初始pH对藏灵菇增殖的影响 以1%的接种量将藏灵菇接种于初始pH分别为6.18、6.28、6.38、6.48、6.58的培养基中，23℃培养22h后过滤，更换培养基并连续培养五批后称重，计算其增殖率。

1.2.3.2 接种量对藏灵菇增殖的影响 分别以1%、3%、5%、7%、9%的接种量将藏灵菇接种于初始pH 6.48的培养基中，23℃培养22h后过滤，更换培养基并连续培养五批后称重，计算其增殖率。

1.2.3.3 温度对藏灵菇增殖的影响 以1%的接种量将藏灵菇接入初始pH 6.48的复合培养基中，分别在18、23、28、33、38℃培养22h后过滤，更换培养基并连续培养五批后称重，计算其增殖率。

1.2.3.4 培养时间对藏灵菇增殖的影响 以1%的接种量将藏灵菇接入初始pH 6.48的复合培养基中，23℃培养16、19、22、25、28h后过滤，更换培养基并连续培养五批后称重，计算其增殖率。

1.2.4 藏灵菇增殖条件的优化 采用部分因素实验设计（Fractional Factorial Design），确定影响藏灵菇增殖的主要因素。部分因素设计因素水平表如表1所示。

表1 部分因素设计因素水平表Table 1 Levels and codes of variables of fractional factorial design（FFD）

利用最陡爬坡实验确定出中心组合设计（Central Composite Design）的中心点，最后通过中心组合实验优化藏灵菇的增殖条件[16-18]。

2 结果与分析

2.1 培养条件对藏灵菇增殖的影响

由图1可见，pH、接种量、温度、培养时间等培养条件对藏灵菇的增殖均有一定影响。初始pH为6.18～6.48之间时，藏灵菇的增殖率呈现逐渐增高的趋势，当pH达到6.48时藏灵菇增殖率最大，达到213.72%，随后增殖率开始变小。这主要是由于pH过高或过低会抑制菇体中固有菌群的生长，从而影响到菇体的增殖。藏灵菇增殖最佳pH为6.48，与新鲜牛乳初始pH 6.5～6.7接近，这是由于在pH 6.48时，培养基拥有最优的离子环境，通过灭菌后营养物质能够较好地保存，因而更有利于藏灵菇的生长繁殖。

在培养过程中，随着藏灵菇接种量不断增大增殖率逐渐降低。接种量为1%时，藏灵菇的增殖率最大，达到196.43%。藏灵菇增殖率随着接种量的增加而减少，可能是由于接种量菇体增多时，微生物对营养物质的竞争性增强引起的。Dem irhan等[4]研究开菲尔粒时发现，随着开菲尔粒接种量的增加（2.5%～10%），其增殖率也呈下降趋势。

不同温度培养时藏灵菇的增殖率有较大差别，温度过低或过高都会影响菇体的增殖，在23℃培养时增殖率最高。这主要是因为温度过低会导致藏灵菇中的微生物生长速度减缓，而温度过高会使菇体中乳酸菌的快速繁殖，引起乳酸的迅速积累，培养基pH迅速下降，不利于其他微生物的生长[12]。Demirhan等[4]研究开菲尔粒增殖时也发现温度对其生长影响较大，其最适培养温度为25℃。Gorsek和Tramsek[11]报道了另一种开菲尔粒在24℃条件下增殖率最大。

藏灵菇培养16～22h时其增殖率随时间的延长逐渐增大，22h后开始缓慢下降，这可能是由于培养后期培养基中营养物质缺乏、代谢产物积累导致复合微生物群整体活性下降，从而使得藏灵菇增殖率下降。Dem irhan等[4]研究发现随着培养时间的延长，开菲尔粒的增殖率呈下降趋势，并在20h后几乎不增长，这与本实验结果类似。

图1 培养条件对藏灵菇增殖的影响Fig.1 Effectof the culture condition on Tibetanmushroom proliferation

2.2 藏灵菇增殖条件的优化

2.2.1 部分因素实验 部分因素设计因素水平实验结果见表2。

基于单因素实验结果，采用部分因素实验设计法考察各因素水平对藏灵菇增殖的影响程度，实验及分析结果分别见表2、表3。回归分析表明模型的R2=0.9927，说明本实验设计能够较好模拟藏灵菇培养过程中各因素对其增殖率的影响。其中温度（p＜0.0001），接种量（p＜0.0001）是两个关键的影响因素，由表3回归分析方程系数可知，温度的系数显著性为正，接种量的系数显著性为负，这表明升高温度和减少接种量对藏灵菇增殖有利；二者都在99.9%的概率水平上差异极显著，而其他因素对藏灵菇增殖率的影响均差异不显著，因而选择温度和接种量两个因素作为后续的研究对象。

表2 部分因素设计及其实验结果Table 2 Design and results of FFD

表3 部分因素设计对藏灵菇增殖率的回归分析结果Table 3 Results of FFD regression analysis for Tibetanmushroom increase

2.2.2 最陡爬坡实验 根据表3中参数分析值，代表温度的变量X1和代表接种量的变量X2为藏灵菇增殖的主要影响因素，X1为正值，X2为负值。因而选择X1和X2进行最陡爬坡实验，以确定响应面实验中心点。代表pH的变量X3和代表培养时间的变量X4固定在中心点水平。

针对X1和X2设计最陡爬坡实验，实验设计和结果如表4所示。随着温度升高、接种量下降的同时，增值率持续增加，在第5组实验中达到最高值239.95%，之后又开始下降，因此以温度23℃，接种量1%作为中心组合设计的中心点。

表4 最陡爬坡试验设计和结果Table 4 Design and results of the steepestascent

2.2.3 中心组合实验 以爬坡实验得到的结果作为中心点，以温度（X1）和接种量（X2）作为自变量、藏灵菇的增殖率（Y）作为响应值，采用中心组合设计对其进行优化，实验因素水平及结果见表5。

表5 中心组合实验的设计及响应值结果Table 5 Test design and results of central composite design

利用Design Expert 7.0拟合实验结果得到回归方程：Y=262.00+15.68X1+6.83X2+6.42X1X2-83.45X12-45.38X22。

回归方程在α=0.01水平上显著，因而回归方程对实验拟合情况很好。该模型的相关系数为R2= 0.9250，表明92.5%的藏灵菇增殖率可由该模型解释。从表6的中心组合方差分析中可以发现，温度（X1）和接种量（X2）的p值都大于0.05，该模型不是线性模型。同时温度和接种量的交互作用（p=0.65）也不显著，但X12（p＜0.001）在99.99%的概率水平上对响应值的影响显著，X22（p=0.01）在99%的概率水平上对响应值的影响显著。以温度和接种量作为平面坐标，以藏灵菇增殖率作为响应值，绘出计算的三维响应图，证实了拟合曲面有极大值，见图2。对回归方程求导，得到极大值为263.04%，对应的接种量为1.02%，温度为23.19℃。为方便称取藏灵菇，接种量定为1.1%，为方便设定温度，定为23.2℃，在这一条件下进行三次重复实验，藏灵菇三次重复的增殖率分别为248.72%、251.76%、257.80%，平均增殖率为252.67% ±4.54%，与模型预测值接近，说明该数学模型对藏灵菇增殖率的预测较为准确。

表6 中心组合试验方差分析Table 6 Analysis of variance for CCD

图2 中心组合设计响应面图Fig.2 Surface plotof CCD

3 结论

影响藏灵菇增殖的因素有很多，本实验通过部分因素设计实验确定对藏灵菇增殖影响最显著的两个因素为温度和接种量；通过中心组合设计和响应面分析对藏灵菇在复合培养基中的增殖条件进行了优化，结果表明，当培养条件为初始pH6.48、接种量1.1%、温度23.2℃、培养时间22h时，获得藏灵菇的最大增殖率为252.67%±4.54%。

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Optim ization of the proliferative condition of Tibetan mushroom

ZHAO Xiao-yuan，WEN Peng-cheng，AIDui-yuan，YANG M in，LIANG Qi，M ILan，ZHANG Yan，ZHANG W ei-bing*
（College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China）

Using sing le factor experiment，fractional factorial experiment and central com posite design to op tim ize the p roliferative cond ition of Tibetan mushroom in compound media，the result showed that tem perature and inoculation amount had significant effec ts on the p roliferation of Tibetan mushroom.The op timal condition as follows：when inoculation amount of 1.1%（w/v），tem perature of 23.2℃，initial pH6.48 and rep lacing time ofmed ium 22h，the p red iction of the maximum value was 263.04%.The result of verification test showed that the p roliferative rate of Tibetanmushroom would be 252.67%±4.54%under the cond ition.

Tibetan mushroom；p roliferation；op tim ization

TS201

A

1002-0306（2012）20-0238-04

2012－04－23 *通讯联系人

赵小元（1987-），男，硕士研究生，研究方向：乳品微生物。

国家农业科技成果转化资金项目（2012GB2G100461）；兰州市科技创新人才团队培育计划项目（2011-1-144）。