陈海琴，杨 波，许庆炎，宋元达，陈 卫，张 灏

（江南大学食品学院，食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡 214122）

植物乳杆菌ZS2058生物转化共轭亚油酸反应条件的优化研究

陈海琴，杨 波，许庆炎，宋元达，陈 卫*，张 灏

（江南大学食品学院，食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡 214122）

对本实验室从泡菜中筛选到的植物乳杆菌ZS2058完整细胞生物转化共轭亚油酸的反应条件进行了系统研究。在1mL磷酸钾缓冲液反应体系中，通过单因素实验和响应面分析，确定最合适的反应条件为：亚油酸底物浓度为0.8mg/mL，细胞浓度为4×1010cfu/mL，反应温度为37℃，缓冲液pH为6.7。在此反应条件下，cis9，trans11-CLA的浓度为374.24μg/mL，转化率高达46.78%，这对于实现共轭亚油酸的高效生产和研究其生理功能具有重要的现实意义和理论价值。

共轭亚油酸，生物转化，植物乳杆菌，转化率

共轭亚油酸（Conjugated Linoleic Acid，CLA）是一类由亚油酸（Linoleic Acid，LA）衍生的具有共轭双键的异构体的总称，在共轭亚油酸的各种异构体中，c9，t11-CLA和t10，c12-CLA两种异构体被认为最具生物活性，特别是c9，t11-CLA在抗动脉粥样硬化和延缓机体免疫力衰退等方面起着重要作用，c9，t11-CLA是唯一能被动物细胞吸收进入其磷脂层的共轭亚油酸异构体[1-2]，而t10，c12-CLA在减肥等[3]方面具有明显的效果。目前，共轭亚油酸的合成方法主要有化学法和生物法两种，但是，化学法合成共轭亚油酸在其产品中存在多种异构体，并且在终产品中会有溶剂残留，甚至还会产生一些难以处理的反应副产物[4]。而生物合成法较化学法具有异构体成分单一、反应条件温和以及产物中具有较高活性的c9，t11-CLA含量高等特点[5]，近年来已成为研究热点。利用微生物全细胞进行生物转化具有转化效果好、不需添加辅酶及其再生系统等优点，细胞中转化用酶或酶系的存在是决定性因素，而选择一个最佳的反应条件能使酶的催化效率显著提高，原因是酶蛋白的立体结构、活性中心的构象受各反应条件的影响，包括底物浓度、反应介质的pH、反应温度等[6-8]。本实验室已经筛选到一株具有生物转化CLA能力的植物乳杆菌ZS2058，已对其在磷酸钾缓冲溶液体系中的转化条件进行了初步探讨[9]。在此基础上，本文以植物乳杆菌ZS2058完整细胞为研究对象，通过对影响其催化转化的各反应条件进行优化研究，这为了解其催化转化机理，实现生物法高效合成CLA提供了理论依据和实践指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

植物乳杆菌（L.plantarum ZS2058） 本实验室从自制泡菜中分离筛选所得[10]，选用MRS培养基进行实验；亚油酸 纯度≥95%，本实验用脲包法制备；共轭亚油酸 纯度≥99%，美国SIGMA公司；其他试剂 均为国产分析纯。

GC2010气相色谱仪 日本岛津公司；UNIVERSAL32R冷冻离心机 德国HETTICH公司；BPX-70毛细管色谱柱 120m×0.25mm i.d.×0.25μm，SGE公司；其余为实验室常规仪器。

1.2 实验方法

1.2.1 气相色谱法（GC） 在前期工作[11]基础上作了改进，具体如下：

1.2.1.1 气相色谱条件 柱前压：366.3kPa；进样口温度：250℃；检测器温度：250℃；空气压力：50kPa；氢气压力：60kPa；氮气压力：100kPa。

1.2.1.2 程序升温条件 150℃保持5m in，然后以5℃/m in的升温速率将温度升至190℃，在此温度下保持0.1m in，再以3℃/m in的升温速率将温度升至220℃，在此温度下保持15m in。分流比：5∶1，进样量：1μL。

1.2.1.3 计算转化产物中CLA的浓度 采用峰面积归一化法计算转化产物中CLA的浓度。

1.2.2 细胞收集 从斜面挑取菌种在10m L MRS培养基中连续活化两次，以体积分数1%接种量接入400m LMRS培养基，37℃诱导培养（0.5mg/m L LA诱导）12h。培养结束后冷冻离心（4500×g，10min，4℃）收集菌体，并用无菌生理盐水洗涤两次，洗涤后直接收集细胞或用0.1mol/L的磷酸钾缓冲溶液（pH 6.5）制成细胞悬浮液备用。

1.2.3 反应条件优化实验

1.2.3.1 反应时间对生物转化CLA的影响 分别取1m L细胞悬浮液置于10m L具塞磨口三角瓶中，添加LA乳浊液至终浓度为0.8mg/m L，使细胞浓度约为4.0×1010cfu/m L，于37℃ 200r/m in条件下分别反应0、1、2、3、4、5、6、8、10、12、16、20、24、26、28h后取出，提取脂肪酸经甲酯化后进行GC分析，研究不同反应时间生物转化CLA的情况，确定生物转化CLA合适的反应时间。

1.2.3.2 氧环境对生物转化CLA的影响 分别取1m L细胞悬浮液置于10m L含有不同氧气浓度（厌氧、微氧和好氧）的三角瓶中，添加LA乳浊液至终浓度为0.8mg/m L，使细胞浓度约为4.0×1010cfu/m L，于37℃200r/m in条件下反应24h后取出，提取脂肪酸经甲酯化后进行GC分析，研究植物乳杆菌ZS2058在厌氧、微氧和好氧条件下对生物转化CLA的影响，确定最佳氧气条件。无氧条件：在10m L具塞磨口三角瓶中，加入1m L细胞悬浮液，充N22m in，排净三角瓶中的空气，迅速将磨口塞塞紧。微氧条件：在10m L具塞磨口三角瓶中，加入1m L细胞悬浮液，将磨口塞塞紧，保留三角瓶中9m L的空气。有氧条件：在10m L敞口三角瓶中，加入1m L细胞悬浮液，用棉布包扎好瓶口，防止空气中的杂质进入，使三角瓶与外界空气流通。

1.2.3.3 细胞浓度对生物转化CLA的影响 将收集到的细胞用磷酸钾缓冲溶液稀释成不同细胞浓度的细胞悬浮液，取1m L悬浮液于10m L具塞磨口三角瓶中，添加LA乳浊液至终浓度为0.8mg/m L，使菌体细胞浓度分别为0、1.0×1010、2.0×1010、3.0×1010、4.0×1010、5.0×1010、6.0×1010cfu/m L，于37℃200r/min条件下反应24h后取出，提取脂肪酸经重氮甲烷直接甲酯化后进行GC分析，研究细胞浓度对生物转化CLA的影响。

1.2.3.4 底物LA浓度对生物转化CLA的影响 取1m L细胞悬浮液于10m L具塞磨口三角瓶中，分别添加LA乳浊液至终浓度为0、0.1、0.3、0.5、0.8、1.0、1.5、2.0、3.0mg/m L，此时菌体细胞浓度约为4.0×1010cfu/m L，于37℃200r/m in条件反应24h后取出，提取脂肪酸经重氮甲烷甲酯化后进行GC分析，研究底物浓度对生物转化CLA的影响。

1.2.3.5 反应缓冲液pH对生物转化CLA的影响 将收集到的细胞分别用不同pH 4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5的磷酸钾缓冲溶液进行悬浮，分别取1m L悬浮液于10m L具塞磨口三角瓶中，添加LA乳浊液至终浓度为0.8mg/m L，使菌体细胞浓度约为4.0×1010cfu/m L，于37℃200r/m in条件下反应24h后取出，提取脂肪酸经甲酯化后进行GC分析，研究pH对生物转化CLA的影响。

1.2.3.6 反应温度对生物转化CLA的影响 取1m L细胞悬浮液于10m L具塞磨口三角瓶中，添加LA乳浊液至终浓度为0.8mg/m L，此时菌体细胞浓度约为4.0× 1010cfu/m L，分别于不同的温度条件下（7、17、27、37、47、57℃）200r/m in反应24h后取出，提取脂肪酸经重氮甲烷甲酯化后进行GC分析，研究反应温度对生物转化CLA的影响。

1.2.3.7 响应面分析法优化生物转化CLA的条件 根据单因素实验的结果，选取生物转化反应体系中影响显著的底物浓度、细胞浓度和pH三个因素为自变量，以CLA的产量为响应函数，三因素三水平的实验设计方案见表1，响应面图的绘制和数据处理均采用SAS软件。

表1 响应面实验设计因素水平表Table 1 Factors and levels of response surfacemethodology

2 结果与讨论

2.1 反应时间对生物转化CLA的影响

反应时间的长短会对生物转化CLA有直接影响，若反应时间太短，则CLA的积累不充分；若反应时间太长，则CLA易被氧化。反应进程曲线见图1，结果表明，在整个反应过程中，前8h可认为是异构化反应的初始阶段，有利于CLA的积累，在此阶段c9，t11-CLA的产量随着反应时间的推移呈线性增加；8h之后的反应速度增加缓慢，当反应至15h时，c9，t11-CLA的产量又开始线性增加，直到22h后，CLA的产量不再增加。而t，t-CLA的浓度在整个反应的过程中略微上升。

从这个过程还观察到c9，t11-CLA的产量呈现了二次增长的过程，分析其原因，可能与亚油酸异构酶转化CLA存在明显的底物抑制作用有关，关于其二次增长的机理，将会在后续工作中进一步研究。

图1 反应进程曲线图Fig.1 The curve of reaction of the process

2.2 氧环境对生物转化CLA的影响

CLA中存在共轭双键，极易被氧化，因此可通过控制反应体系中的氧气条件防止其被氧化。据Ogawa等[8]报道，利用乳酸菌洗涤细胞的催化能力在微氧条件下更有利于CLA的积累，具有更好的发展前景。这和钮晓燕[9]报道的植物乳杆菌ZS2058生物转化CLA不受氧气浓度的限制，并且CLA的氧化程度亦不会受氧气浓度的影响的结论不一致。本文通过改变反应体系中不同的氧环境来研究无氧、微氧和有氧条件对生物转化CLA的影响。图2、图3结果显示，植物乳杆菌ZS2058在无氧条件下生物转化CLA时有大量的LA转化成了t，t-CLA；在微氧条件下转化时，LA转化成c9，t11-CLA的比例较高；而在好氧条件下转化时，LA转化成c9，t11-CLA和t，t-CLA的比例相当。

图2 不同含氧环境下生物转化CLA的GC图Fig.2 Gas chromatograms of CLA methyl esters produced under different oxygen content

由于c9，t11-CLA被公认为是最具有活力的CLA之一，是唯一能被动物细胞吸收进入其磷脂层的共轭亚油酸异构体，而关于t，t-CLA的功能活性未见报道，且关于分离获得单个异构体的技术尚未成熟。因此本文选择在微氧条件下进行反应，一方面可以得到较高含量的c9，t11-CLA，另一方面，专一性转化c9，t11-CLA的比例较高，减轻了分离c9，t11-CLA和t，t-CLA的工作。氧环境对生物转化CLA的影响实验表明，活性CLA的产量与氧气浓度的大小有着密切的联系。

图3 氧气对生物转化CLA的影响Fig.3 Effectof oxygen on the bioconversion of CLA

2.3 细胞浓度对生物转化CLA的影响

利用微生物合成CLA，其实质是利用细胞中的酶或酶系异构化LA。因此，在利用植物乳杆菌ZS2058完整细胞催化转化的反应体系中，可通过改变体系中的细胞浓度来调节参与反应的酶量，进而获得较好的转化效果。从图4可以看出，当细胞浓度为4× 1010cfu/m L时，c9，t11-CLA产量比较高，随着细胞浓度进一步增加，酶量逐渐过量，反应达到平衡，终产物比例基本不变。而t，t-CLA的产量与c9，t11-CLA相比较低，当细胞浓度为3×1010cfu/m L时产量就趋于平稳。

图4 细胞浓度对生物转化CLA的影响Fig.4 Effectof cellmass on the bioconversion of CLA

2.4 底物浓度对生物转化CLA的影响

在酶催化的反应体系中，酶和底物是最基本的构成因素。不同的底物浓度（即LA浓度）会直接影响酶催化转化的反应速度，从而影响对底物的转化效果。如图5所示，在底物浓度小于0.8mg/m L的范围内，细胞量充足，只有少数的细胞和底物作用生成中间产物，在这种情况下，增加底物的浓度，就会增加产物c9，t11-CLA的含量；当底物浓度大于1mg/m L时，底物浓度足够大，所有的细胞都与底物结合反应，体系中已经没有游离态的细胞，继续增加底物浓度不能提高产物c9，t11-CLA的量，由于可能存在一定的底物抑制现象，c9，t11-CLA的含量略微有所下降，而t，t-CLA的底物抑制浓度与c9，t11-CLA有所不同，当LA浓度为0.3mg/m L的时候就出现了底物抑制现象。

图5 底物浓度对生物转化CLA的影响Fig.5 Effectof substrate concentration on the bioconversion of CLA

2.5 反应缓冲液pH对生物转化CLA的影响

在微生物细胞生物转化的反应过程中，反应体系的pH不但会影响酶蛋白的构型和酶的稳定性以及酶的活性中心必需基团的解离状态和底物的解离状态，还会影响涉及氧化还原反应的辅酶体系和反应中氢的传递及电子的转移。在最适pH条件下，酶催化转化反应的活性最佳，转化效果最好，高于或低于此pH时，酶的活性会下降。

从图6可以看出，反应体系pH在6.5左右时，植物乳杆菌ZS2058生物转化CLA的产量最高，pH过低或过高都很大程度的影响了酶活，使产物转化率下降。因此，该反应适合在中性环境中进行。

图6 反应pH对生物转化CLA的影响Fig.6 Effect of pH value on the bioconversion of CLA

2.6 反应温度对生物转化CLA的影响

反应温度对酶催化转化反应的影响有两个方面：一方面，随着温度升高，活化分子数增多，酶反应速度加快；另一方面，随着温度升高，酶蛋白逐步变性失活，酶的活性随之降低，减弱转化效果。图7结果表明，温度在37℃左右时，较适合生物转化反应的进行，温度过低或过高都很大程度的影响酶活，使产物转化率下降。

2.7 响应面分析优化生物转化CLA的条件

图7 反应温度对生物转化CLA的影响Fig.7 Effect of temperature on the bioconversion of CLA

响应面实验设计的实验结果见表2。15个实验点可分为两类，其一是析因点，自变量取值在X1、X2、X3所构成的三维顶点，共有12个析因点；其二是零点，为区域的中心点，零点实验重复3次，用以估计实验误差。

表2 响应面分析结果Table 2 The results of response surface analysis

以CLA产量（Y）为响应值，运用SAS-RSR（Response Surface Regression）程序对15个实验点响应值进行回归分析，经回归拟合后，得到如下回归方程：

回归方程及各项的方差分析如表3所示。

从方差分析表中可以看出，各因素中一次项X1、X2项是高度显著的，二次项X12、X22项也是高度显著，X1X2项是显著的。因此，各具体实验因子对响应值的影响不是简单的线性关系，回归方程也是高度显著的。相关系数R2=0.9725，说明响应值（Y）有97.25%来源于所选变量的实验范围，即底物浓度、细胞浓度和pH。

从实验所得的响应面分析图（图8）上，能够较为直观地找出最佳条件及各因素在反应中的相互作用。

对回归方程中X1、X2、X3求偏导，计算得到生物转化CLA的最优条件为：底物浓度：0.85mg/m L；细胞浓度：4.13×1010cfu/m L；pH：6.74，得到理论CLA产量为：376.93μg/m L。所以考虑到实际操作的方便，结合方差分析表及响应面分析图，确定最佳转化CLA的条件为：底物浓度：0.8mg/m L；细胞浓度：4×1010cfu/m L；pH：6.7。

表3 回归方程的方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

图8 生物转化CLA影响因素的RSA响应面图Fig.8 The chartof response surface analysis forCLA transformation condition

在此最佳因素组合的条件下进行生物转化反应，优水平组合条件下反应产物的气相色谱图见图9。利用峰面积归一化法可以求得c9，t11-CLA、t10，c12-CLA和t，t-CLA的浓度分别为374.24、6.71、110.08μg/m L，与理论值相符，CLA总的转化率为60.54%，其中c9，t11-CLA占总CLA含量的77.27%，转化率为46.78%，比钮晓燕等[9]报道的在20m L的反应体系中的CLA转化率提高了47.29%。

图9 优水平组合条件下反应产物GC分析图Fig.9 Gas chromatogram of products under the optimized reaction condition

3 结论

本文对L.plantarum ZS2058完整细胞在1m L磷酸钾缓冲液反应体系中的反应条件进行了系统优化，通过单因素实验和响应面分析，确定了最合适的生物转化反应条件，在此反应条件下c9，t11-CLA的浓度为374.24μg/m L，转化率高达46.78%。本文的研究工作将为最大限度地发挥酶催化反应的高效率提供实验依据，也为实现共轭亚油酸的高效生产和研究其生理功能提供借鉴。

[1]Jones E L，Shingfield K J，Kohen C，etal.Chemical，physical，and sensory properties of dairy products enriched with conjugated linoleic acid[J].Journal of Dairy Science，2005，88（8）：2923-2937.

[2]Pariza M.Perspective on the safety and effectiveness of conjugated linoleic acid[J].American JournalofClinicalNutrition，2004，79：1132S-1136S.

[3]Pariza M，Park Y，Cook M.The biologically active isomers of conjugated linoleic acid[J].Progress in Lipid Research，2001，40：283-298.

[4]Guo Z，Zhang GW，Sun Y.Preparstiong of conjugated linoleic acid and identification of its isomers[J].Chinese Journal of Chemical Engineering，2003，11（2）：130-135.

[5]Lin T Y.Conjugated linoleic acid production by cells and enzyme extract of Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus with additions of different fatty acids[J].Food Chemistry，2006，94（3）：437-441.

[6]周倩，刘佩，李海霞，等.微生物合成共轭亚油酸机理的研究进展[J].食品工业科技，2011，32（11）：468-474.

[7]杨宏，叶淑红，王晗，等.混菌发酵产共轭亚油酸条件的优化[J].食品工业科技，2011，32（8）：220-222.

[8]Ogawa J，Kishino S，Ando A，et al.Production of conjugated fatty acids by lactic acid bacteria[J].Journal of Bioscience and Bioengineering，2006，100（4）：355-364.

[9]钮晓燕，陈卫，张灏，等.植物乳杆菌ZS2058在磷酸盐缓冲液体系中生物转化共轭亚油酸[J].微生物学报，2007，47（2）：244-248.

[10]周凌华，张灏，陈卫，等.生物合成共轭亚油酸菌种的筛选与鉴定[J].无锡轻工大学学报，2004，23（5）：53-57.

[11]许庆炎，陈海琴，田丰伟，等.植物乳杆菌ZS2058生物转化产物共轭亚油酸的分析方法的研究[J].食品与发酵工业，2008，34（1）：110-114.

Study on condition optim ization of conjugated linoleic acid bioconversion by Lactobacillus plantarum ZS2058

CHEN Hai-qin，YANG Bo，XU Qing-yan，SONG Yuan-da，CHENW ei*，ZHANG Hao
（State Key Laboratory of Food Science and Technology，School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi214122，China）

The converted cond ition of LA to CLA by using Lactobacillus p lantarum ZS2058，which was screened from the Chinese traditional fermented vegetab le，was stud ied.Accord ing to the p roduction of CLA，bioconversion of CLA by resting cells of L.p lantarum ZS2058 in 1m L potassium phosphate buffer system was op tim ized.Through the sing le factor experiment and response surface analysis，374μg/m L of c9，t11-CLA was ob tained under the reaction cond ition as follows：0.8mg/m L LA solution，4×1010c fu/m L cell mass，op timal tem perature 37℃and the op timalpH value 6.7，and the conversion ratio of c9，t11-CLA was 46.78%，which was valuab le for p roducing CLA efficiently and studying its physiological function.

conjugated linoleic acid；bioconversion；Lac tobacillus p lantarum；conversion ratio

Q558

A

1002-0306（2012）22-0192-06

2012－07－20 *通讯联系人

陈海琴（1978-），女，博士，副教授，主要从事食品生物技术方向的研究。

“十一五”国家“863计划”（2007AA100402）；“十二五”国家“863计划”（2011AA100905）。