吴 杰，郑 影，谷思云，王 萍，*，刘晓娜

（东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨 150040）

笃斯越橘产品花色苷抗氧化活性评价

吴 杰1，郑 影1，谷思云2，王 萍2，*，刘晓娜2

（东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨 150040）

对笃斯越橘不同产品花色苷的抗氧化活性进行了研究。首先用60%乙醇提取笃斯越橘产品花色苷，再用AB-8大孔树脂分离，pH示差法测定花色苷含量，最后采用·OH和DPPH·体系对笃斯越橘产品的抗氧化活性和规律性进行了测定和比较。结果表明，花色苷的抗氧化活性和花色苷含量成显著正相关。果酱类产品中花色苷含量最高；不同笃斯越橘产品中花色苷抗氧化能力不同。清除·OH的IC50最小的为8.83μg/mL，最大的为43.24μg/mL；清除DPPH·的IC50最小的为10.48μg/mL，最大的为20.40μg/mL。

笃斯越橘产品，花色苷，抗氧化

笃斯越橘（Vaccinium uliginosum Linn.）为杜鹃花科（Ericaceae）越橘属（Vaccinium spp.）植物，其成熟的浆果为蓝色或蓝黑色，外皮一层白粉，故俗称为“蓝莓”（Blueberry），黑龙江省产区也称“都柿”，是越橘的一个资源品种[1]。笃斯越橘是蓝莓的野生品种，在我国的东北地区大面积生长。笃斯越橘含有丰富的花色苷，花色苷是花青素与糖以糖苷键结合而成的一类化合物，具有抗氧化[2]、消除自由基、降低血清胆固醇、抗变异、抗肿瘤、抗癌、促进视网膜上视红素再合成等生理功能，可预防和治疗青光眼和其他眼类疾病[3]，因此蓝莓被联合国粮农组织（FAO）确定为人类五大健康食品之一[4]。随着预防衰老、抗癌等越来越成为人们对饮食生活健康的追求，因此在市场上这类的野生浆果产品琳琅满目。而目前国内对笃斯越橘的研究主要集中在鲜果上，对笃斯越橘产品的研究尚少。花色苷容易受到各种因素影响而降解，如温度、pH、光照、氧气、酶，并且在各种加工步骤中也易发生降解反应[5]。已有研究证明，当蓝莓加工成果汁和果汁浓缩液时有大量的花色苷和酚类物质损失，特别是当磨粉和脱果胶时由于被本身含有的多酚氧化酶氧化降解而产生最大的损失[6]。本实验选取以东北地区笃斯越橘为原料的产品，通过对花色苷进行分离、纯化，分析其体外抗氧化活性，对该产品的生产和消费极具现实意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蓝莓笃斯越橘产品 购于各大超市；氢氧化钠、双氧水、磷酸氢二钠、冰乙酸、盐酸、水杨酸、硫酸亚铁、柠檬酸 均为分析纯；AB-8大孔树脂 天津波鸿树脂科技有限公司；无水乙醇 天津市天力试剂有限公司；DPPH·（2，2-二（4-叔辛基苯基）-1-苦基肼，分子式C34H44N5O6，分子量618.74） 美国Sigma公司。

RE-52A旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；722分光光度计 上海第三分析仪器厂；DK-98-1电热恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司；开放式层析柱30mm×500mm 青岛博阳仪器有限公司；PHS-3C雷磁精密pH计 上海精密仪器有限公司；T6紫外光谱扫描仪 北京普析通用仪器有限责任公司；JA2003电子天平 上海象平仪器仪表有限公司；TGL-16G高速离心机 上海安亭科学仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 实验样品 选购了11种以黑龙江地区笃斯越橘为原料的产品，其中7种果汁、1种原浆、3种果酱。产品的主要信息见表1。

1.2.2 笃斯越橘产品花色苷粗提物制备 量取一定量的笃斯越橘产品（果汁取20m L，果酱取10g，果浆取20m L），分别按照料液比1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16加入60%的乙醇溶液，提取温度40℃、提取时间60m in。将经过离心、抽滤、减压浓缩后得到的不同料液比的溶液定容到相同的体积，测定吸光值[7]。吸光值最大的确定为最佳料液比。

根据产品规格取一定量产品，按最佳料液比浸提收集滤液。滤渣按同样的提取条件重复浸提两次，至笃斯越橘产品浸提液为无色或浅褐色。3次所得滤液合并后于50℃下减压浓缩得到棕红色的粗提液[8]。

1.2.3 AB-8大孔树脂对花色苷粗提物的纯化 预处理过的AB-8大孔树脂[9]采用湿法上柱，用5%盐酸溶液洗2h后用蒸馏水水洗至中性，用5%NaOH碱溶液洗2h，再用蒸馏水水洗至中性，备用。花色苷粗提物以10m L/m in的流速通过层析柱，吸附至饱和后平衡吸附4h。用三倍柱体积的蒸馏水洗涤杂质，用pH 2的70%乙醇洗脱液进行洗脱，洗脱流速为1m L/m in[8]，收集所有红色颜色的洗脱液（洗脱量大于95%）。洗脱液在50℃条件下减压浓缩，定容。

1.2.4 纯化笃斯越橘产品花色苷含量的测定

1.2.4.1 最大吸收波长 取1m L的花色苷纯化液用9m L pH 3.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液稀释，以1m L蒸馏水代替花色苷加9m L pH 3.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液稀释作为参比[10]，采用紫外-可见光扫描仪于200～800nm下全波长扫描，确定其最大吸收波长为测定波长。

1.2.4.2 花色苷含量的计算 采用pH示差法，取1m L花色苷浓缩液，分别用pH1.0和pH4.5的缓冲液[11]稀释到一定倍数，混匀。以1m L溶剂代替样液作空白，分别在最大波长X和700nm处测定吸光值[12]。做3次平行实验。总花色苷的含量（以矢车菊色素-3-葡萄糖苷计）按下式计算：

式中，V：代表纯化液的总体积，m L；Mw：代表矢车菊色素-3-葡萄糖苷的相对分子质量，449.2mg/mol；Df：代表稀释因子（样品总的稀释倍数）；ε：代表矢车菊色素-3-葡萄糖苷的摩尔消光系数，26900moL-1；l：代表光程，1cm；v：代表产品体积，m L；蒸馏水作参比；用A700nm来消除样液浑浊的影响。

1.2.5 抗氧化活性测定

1.2.5.1 对·OH清除能力的测定 采用水杨酸法测定花色苷对·OH的清除能力[13]。花色苷浓度为10、20、30、40、50、60μg/m L。按照表2添加药品，最后加H2O2启动反应，37℃反应0.5h，以蒸馏水作参比，在最大波长下测定各浓度的吸光度。每一吸光值平行测3次，取其平均值。抗坏血酸作阳性对照。

式中，A0：代表对照液的吸光度；A1：代表加入花色苷溶液后的吸光度；A2：代表不加显色剂H2O2花色苷溶液的吸光度（花色苷本底值）。

1.2.5.2 对DPPH·清除能力的测定 花色苷对DPPH·清除能力的测定采用分光光度法[14-15]。所用DPPH·溶液浓度为2×10-4mol/L（95%的乙醇溶解），分别取不同浓度的花色苷溶液2m L及2m L DPPH·溶液加入同一具塞试管中，摇匀后放置30min，以乙醇作参比，分别测定517nm处的吸光度A1。同时测定2m L不同浓度花色苷溶液与2m L乙醇混合后517nm的吸光度A2，再测定2m L DPPH·溶液与2m L乙醇混合液517nm的吸光度A3。将根据公式计算其抑制率。每一吸光值平行测3次，取其平均值。抗坏血酸作阳性对照。

表1 实验样品Table 1 Experimental samples

式中，A1：代表加测定溶液后DPPH·的吸光度；A2：代表测定溶液在测定波长的吸光度；A3：代表未加测定溶液时DPPH·的吸光度。

2 结果与分析

2.1 实验样品花色苷提取条件的最适料液比

随着料液比的增加，花色苷的吸光值增大，趋于平缓后又降低。当几组料液比的花色苷吸光值差异不显著时，考虑到溶剂用量过大而造成浪费，本实验选取的为溶剂用量较少的最适料液比。11种样品花色苷提取液的最适料液比见表3。

表3的结果表示，不同笃斯越橘产品中花色苷的最适料液比不同。原因是产品中花色苷含量、产品加工工艺、产品状态不同。因为产品与鲜果相比含水量及组织状态不同，本实验只对笃斯越橘产品的提取料液比进行了探究，提取时间60min、提取温度40℃为本校实验的研究结果，不再进行探究。

2.2 实验样品中花色苷含量的平均浓度

从表4可以看出花色苷含量较高的是果酱类产品，B3花色苷含量最高，A2花色苷含量最低。

笃斯越橘果汁产品中花色苷浓度范围为15.820～ 44.370μg/m L，果酱（浆）产品中花色苷浓度范围为69.254～119.027μg/m L。原浆C1的花色苷含量小于果酱B1、B2和B3，是因为笃斯越橘产品原浆并非含有百分之百的原果，果酱中除笃斯越橘外，无含花色苷的其他物质，采用pH示差法得出的结果为目标物中单体花色苷，原浆花色苷含量小于果酱，原因为产品加工、贮藏过程中花色苷存在状态变化所致。参照表1和表4，性价比较好的产品是B3、B1及A7，性价比较差的是A2。

2.3 笃斯越橘花色苷精制物抗氧化活性评价

2.3.1 清除·OH的能力

2.3.1.1 澄清果汁产品中花色苷对·OH的清除率 由图1可以看出，4种产品中提取的花色苷对·OH的清除率均高于VC，并且随质量浓度增加其清除率增强。4种产品中，在有效浓度范围10～60μg/m L内，A2对·OH的清除能力最好，A7对·OH清除能力最差。当花色苷浓度大于30μg/m L时，A 5和A1对·OH的清除能力相差不大。

图1 澄清果汁类蓝莓产品中花色苷对·OH的清除率Fig.1 The·OH scavenging rate of anthocyanins in clarified blueberry juice

2.3.1.2 带果粒的果汁产品中花色苷对·OH的清除率 由图2可以看出，3种产品中提取的花色苷对·OH的清除率均高于VC，并且随质量浓度增加其清除率增强。3种产品中，A6对·OH的清除能力最好。当花色苷浓度小于30μg/m L时，A3对·OH的清除能力较A4好，当花色苷浓度大于30μg/m L时，A3和A4对·OH的清除能力基本相当。

2.3.1.3 果酱（浆）产品中花色苷对·OH的清除率由图3可以看出，4种产品对·OH的清除均高于VC，并且随着质量浓度的增加其清除率提高。其中C1对· OH的清除能力最强。当花色苷浓度小于20μg/m L时，B1、B2和B3对·OH的清除率增强的较平缓。当花色苷浓度大于20μg/m L时，B3对·OH的清除能力最差，B1和B2的清除能力基本相当。

表2 对·OH清除率测定方法的试剂添加顺序Table 2 The addition order of the reagent in·OH assay

表3 花色苷提取条件的最适料液比Table 3 Themost suitable solid-liquid ratio of anthocyanin extraction conditions

表4 实验样品中花色苷含量的平均浓度（平均值±标准差）Table 4 The average concentration of anthocyanins content in the experimental samples（mean±standard deviation）

图2 带果粒的果汁类产品中花色苷对·OH的清除率Fig.2 The·OH scavenging rate of anthocyanins in blueberry juice with full fruit

图3 果酱类产品中花色苷对·OH的清除率Fig.3 The·OH scavenging rateofanthocyaninsin blueberry jams

2.3.2 清除DPPH·的能力

2.3.2.1 澄清果汁产品中花色苷对DPPH·清除率 由图4可以看出，4种产品随花色苷浓度增加其对DPPH·的清除率也提高。4种笃斯越橘果汁中对DPPH·清除能力最差的是A5，清除能力较强的是A1和A2，A1和A2为同一厂家生产。当花色苷浓度小于10μg/m L时，4种果汁对DPPH·的清除率都比VC低，当花色苷的浓度大于10μg/m L时，A1和A2的清除率比VC高。

图4 澄清果汁类产品中花色苷对DPPH·的清除率Fig.4 The DPPH·scavenging rate of anthocyanins in clarified blueberry juice

2.3.2.2 带果粒的果汁产品中花色苷对DPPH·的清除率 由图5可以看出，3种带果粒的笃斯越橘果汁中，A4对DPPH·的清除能力最差。当花色苷的浓度小于5μg/m L时，3种果汁对DPPH·的清除能力均小于VC；当花色苷的浓度大于15μg/m L时，A6的清除能力最强，A3和VC的清除能力基本相当。

图5 带果粒的果汁类产品对DPPH·的清除率Fig.5 The DPPH·scavenging rate of anthocyanins in blueberry juice with full fruit

2.3.2.3 果酱（浆）产品中花色苷对DPPH·的清除率由图6可以看出，随着花色苷质量浓度的增加，4种产品对DPPH·的清除率也随之增强，C1对DPPH·的清除能力最差。当花色苷的浓度小于5μg/m L时，4种产品对DPPH·的清除能力均小于VC；当花色苷的浓度大于20μg/m L，B2对DPPH·的清除能力均高于其他3种产品。从总体4种产品对DPPH·的清除率而言，B2、B3和C1对DPPH·的清除效果相差不大。

图6 果酱类产品对DPPH·的清除率Fig.6 The DPPH·scavenging rate of anthocyanins in blueberry jams

2.3.3 笃斯越橘产品花色苷清除·OH和DPPH·能力半数抑制浓度（IC50） 清除能力分别以花色苷提取物和VC标准品对·OH和DPPH·的清除率达到50%时对应的浓度IC50值表示，结果见表5。

表5 笃斯越橘产品花色苷提取物清除·OH和DPPH·能力半数抑制浓度表Table 5 The IC50 of the anthocyanins in blueberry products in ·OH and DPPH·assay

·OH IC50值比较：VC＞B3＞A3＞A4＞B1＞A 7＞B2＞A5＞A6＞A1＞C1＞A2；DPPH·IC50值比较：A4＞A5＞A7＞

C1＞B2＞B1＞A3＞A2＞B3＞A1＞VC＞A6。由结果比较可以看出，11种笃斯越橘产品的花色苷提取液对·OH的清除能力均比VC强，A4、A5、A7、C1、B2、B1、A3、A2、B3、A1对DPPH·的清除能力较VC弱，是由于抗氧化机理不同造成的。从IC50值的大小可以看出，同种产品对·OH的清除能力比DPPH·弱。不同的蓝莓产品类型与IC50关系不明显。

2.4 花色苷浓度和抗氧化评价方法之间的相关性研究

2.4.1 花色苷浓度与·OH清除率之间的相关性 由表6可以看出，11种笃斯越橘产品的花色苷提取液及VC标准溶液的浓度与·OH清除率之间的R2均大于0.9，呈显著的正相关性。花色苷对·OH清除率与花色苷含量的相关性分析浓度为5～60μg/m L。

表6 花色苷浓度与·OH清除率的相关性Table 6 The correlation between anthocyanins contentand the·OH scavenging rate

2.4.2 花色苷浓度与DPPH·清除率之间的相关性 由表7可以看出，11种笃斯越橘产品的花色苷提取液及VC标准溶液的浓度与DPPH·清除率之间的R2均大于0.8，呈显著的正相关性。花色苷对DPPH·清除率与花色苷含量的相关性分析浓度为2～20μg/m L。

表7 花色苷浓度与DPPH·清除率之间的相关性Table 7 The correlation between anthocyanins contentand the DPPH·scavenging rate

3 结论

笃斯越橘产品的抗氧化活性研究结果表明，11种笃斯越橘产品花色苷都具有抗氧化活性，可以有效清除DPPH·及·OH。11种笃斯越橘产品中提取的花色苷的抗氧化能力和其花色苷的浓度之间存在着明显的量效关系，且在不同的抗氧化体系中相同浓度下的不同产品的花色苷则表现出不同的抗氧化活性。根据本实验室的研究结果，笃斯越橘经过加工后，与原果相比抗氧化能力降低；不同产品相同浓度花色苷抗氧化活性不同，说明花色苷结构受到加工及环境条件的影响，但总体抗氧化能力降低较少。

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Assessment of the antioxidant activity of anthocyanins from V.uliginosum berry products

WU Jie1，ZHENG Ying1，GU Si-yun2，WANG Ping2，*，LIU Xiao-na2
（School of Forestry，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China）

The antioxidantac tivity of anthocyanins in d ifferent V.uliginosum berry p roducts were analyzed.Firstly，the anthocyanins in V.uliginosum berry p roducts were extracted w ith 60%ethanol，and then separated by an AB-8 macroporous resin column and the pH d ifferential assay was used to determ ine the total anthocyanins content.Finally，the·OH assay and DPPH·assay were used to determ ine and compare the antioxidant capacity and the regular pattern of the V.uliginosum berry p roducts.The result showed that antioxidant capacity of the anthocyanins had a significant positive correlation w ith the anthocyanins content.The jam s had the largest anthocyanins content and the antioxidant capacity of anthocyanins in d ifferent V.uliginosum berry p roducts that was d ifferent.In·OH assay，the least IC50was 8.83μg/m L，and the largest was 43.24μg/m L.In DPPH·assay，the least IC50was 10.48μg/m L，and the largestwas 20.40μg/m L.

V.uliginosum berry p roducts；anthocyanins；antioxidant capacity

TS255.1

A

1002-0306（2012）22-0181-05

2012－05－11 *通讯联系人

吴杰（1990-），女，大学本科，研究方向：食品基础原料开发。

东北林业大学创新实验基金（1110225012）。