张志广，李 熳，闻淑军，江 勇，翟浩宇，季英兰

（天津医科大学第二医院消化科，天津300211）

胃癌目前是影响人类生存的恶性肿瘤之一，幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp)的感染已被公认是胃癌的重要致病因子。但Hp感染后只有极少数发生胃癌，说明胃癌的发生除了Hp感染以外，还与Hp的菌株毒力因素、宿主本身的遗传学因素及环境因素有关[1]。目前已熟知的Hp毒素是细胞毒素相关蛋白（cytotoxin associated protein，CagA）和空泡细胞毒素（vaculating cytotoxin A,VacA）两种，编码它们的基因分别称为cagA和vacA，据文献报道cagA+Hp感染更易加重胃炎的炎症程度和萎缩程度，并与胃癌的发生密切相关[2]。缺氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor-1,HIF-1）是调节肿瘤细胞缺氧反应的主要转录因子，HIF-1α是其活性的亚单位，它可以通过上调其下游的基因来进一步参与肿瘤的侵袭和转移。诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS)就是其下游基因之一，其活性与许多肿瘤的血管生成密切相关[3]。目前有文献报道Hp感染，特别是cagA+Hp感染可通过活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)来稳定HIF-1α的表达[4-5]。本文就cagA+Hp感染与胃癌的临床病理关系及HIF-1α、iNOS的表达做一研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集天津医科大学第二医院1998-2004年间手术切除的胃腺癌标本，临床资料和随访资料完整者198例，其中男137例，女61例，年龄26~86（65.28±11.24）岁。随访时间截止于2010年5月，术后生存时间为1~128月，平均生存时间为（38.25±25.06）月。其中c14呼气试验证实138例患者为Hp阳性，其中男93例，女45例，年龄32~86（66.04±10.02）岁，根据美国癌症协会1997年第5版国际癌症病期 （Tumor NodeMetastasis，TNM）分期标准：Ⅰ期17例，Ⅱ期34例，Ⅲ期56例，Ⅳ期31例。组织学分级：肠型胃癌87例，弥漫型胃癌51例。以上结果均经2名有经验的病理医师重新阅片验证。

1.2 主要试剂 HIF-1α（1∶100稀释，小鼠抗人，Labvision Neomarkers），iNOS（1∶100 稀释，兔抗人，Santa Cruz）。PCR试剂盒购自大连宝生物有限公司。

1.3 常规免疫组织化学染色步骤 石蜡切片常规脱蜡至水后，微波热修复，修复完毕后加入第一抗体，4℃过夜。免疫组织化学染色采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶（SP）法，显示系统为PV-6001/6002（北京中杉），DAB显色，苏木素复染。各指标均设立相应阴性及阳性对照。

1.4 聚合酶链反应（Polymerase chain reaction,PCR）

取石蜡块切片3片（厚12μm），经二甲苯脱蜡后，消化液（500mg/L蛋白酶K，10mmol Tris-HCIpH 8.0，10 mmol NaC1，1 mmol EDTA，100 g/L SDS）消化，酚-氯仿抽提DNA，-20℃备用。cagA引物序列：引物 1，5′-AATACACCAACGCCTCCAAG-3′，引物 2 5′-TTGTTGCCGCTTGCTCTC-3′，由大连宝生物有限公司合成。cagA PCR反应体系为50μL，包括DNA模板2μL，cagA引物1和引物2各0.75μL，Taq DNA 酶 0.5μL，10×Taq缓冲液 5μL，PCR 染液 5 μL，dNTP 1μL，ddH2O 34.5μL。cagA PCR 反应条件：95℃预变性4min后，95℃变性60 s，50℃退火60 s，72℃延伸60 s，共30个循环，循环结束后72℃延伸7min。反应结束后取13μL扩增水相用15 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，cagA在382 bp出现电泳带为阳性。

1.5 免疫组织化学染色结果判定 HIF-1α及iNOS均以肿瘤细胞胞质呈棕黄色为阳性表达，HIF-1α也可见细胞核着色。随机选择10个有代表性的高倍镜视野,每个视野记数100个肿瘤细胞，染色指数等于染色强度（基本不着色、浅黄、深黄和棕色分别为0、1、2、3分）与阳性细胞百分率（阳性细胞百分率 <5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，>50%为3分）计分的乘积。

1.6 统计学分析 应用SPSS16.0统计软件包，计量资料以来表示。应用χ2检验进行率的比较，组间计量资料比较应用t检验及Mann-Whitney检验，采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，Log-rank检验比较生存曲线的差别，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 cagA基因型与胃腺癌临床病理资料之间的关系 通过判定在382 bp出现的凝胶电泳的显影条带（图1），138例胃癌中95例为cagA+，43例为cagA-。

将138例胃癌患者按性别、年龄（≥60岁和＜60岁）、肿瘤位置、大小、浸润深度、组织学分型、血行转移、淋巴结转移和TNM分期进行分组，发现cagA基因与胃癌的浸润深度密切相关，P=0.023（表1）。

表1 cagA与胃腺癌临床病理资料的关系Tab 1 The relation of clinicopathologic data between cagA and gastric adenocarcinom a

2.2 cagA+Hp组和cagA-Hp组之间HIF-1α和iNOS的差异表达 HIF-1α和iNOS阳性表达可见于肿瘤细胞胞质或细胞核（图2）。其在cagA+Hp组的表达均高于cagA-Hp组，P均<0.05（表2）。

2.3 cagA基因型与胃腺癌患者预后之间的关系 cagA+Hp感染组患者的平均生存时间为47.23个月，中位生存时间为34.55个月；cagA-Hp感染组患者的平均生存时间60.47个月，中位生存时间为42.73个月。cagA+Hp组和cagA-Hp组5年生存率分别是28.42%和32.56%。Log-rank值为3.166，P=0.075（图 3）。

表2 cagA+Hp组和cagA-Hp组之间HIF-1α和iNOS的差异表达Tab 2 The differentialexpression of HIF-1αand iNOSbetween the groupsof cagA+Hp and cagA-Hp

3 讨论

Hp在发达国家感染率达30%～50%，在发展中国家则高达80%～90%[6]。研究证实，Hp感染与胃炎、消化性溃疡、MALT淋巴瘤及胃腺癌密切相关。但近20%~30%的感染者可终身携带Hp而不发病；50%以上的感染者仅有不同程度的慢性炎症；10%~15%可发生消化性溃疡；只有极少数发生胃部恶性肿瘤。说明胃癌的发生不仅仅与Hp感染有关，还与细菌的毒力因素，宿主的免疫反应和基因多态性及环境因素有关。

目前研究较多的是cagA基因，它只存在于50%~60%的Hp菌株中，编码细胞毒素相关蛋白（cytotoxin associated protein，CagA）。幽门螺杆菌以IV型分泌系统将CagA直接注入宿主细胞，CagA进入细胞后被细胞内特定的激酶磷酸化，从而引起细胞骨架的重排以及细胞内信号传导系统的变化，最终导致炎症、免疫反应，甚至细胞增殖、分化和凋亡平衡的改变，从而引起恶性病变的可能[7]。据文献报道，cagA+Hp感染与胃炎的炎症程度和萎缩程度及癌变均密切相关，其致癌机制可能是：cagA+基因株产生多种毒素可导致胃黏膜细胞癌基因过度表达，产生内源性突变物质，导致基因突变而发生胃癌；可使胃黏膜表皮生长因子浓度增高，氧自由基、超氧化物生成增加，引起细胞损伤及DNA断裂诱发癌变；增加IL-8的分泌和一氧化氮合成，促进胃黏膜损害，加速胃组织细胞凋亡与癌变[8-9]。

目前大部分研究关注于Hp感染与胃癌的预后，但报道结果并不一致[10-12]。来自于德国和意大利的2篇报道均显示胃癌中Hp阳性感染者的预后要好于Hp阴性感染者，1篇来自中国的研究报告却发现2者之间并无明显差异，他们应用RT-PCR方法检测了Hp的mRNA拷贝数，发现伴有高拷贝数的胃癌患者预后要稍好于低拷贝数者,但无统计学意义。究其原因可能是因为Hp的感染激发了患者对肿瘤细胞的免疫反应，细菌本身的组分可诱导自身抗体出现，与肿瘤细胞产生交叉的免疫反应所致。但这些结论仍然有争议，因为世界各地对于Hp感染的判定标准并非一致。

本研究第一次应用PCR的方法检测Hp的cagA基因型，并比较它与胃腺癌的临床病理特征的关系及预后的意义。笔者发现cagA+Hp感染的胃腺癌大多呈深度浸润，但与肿瘤大小、位置、Lauren分型、淋巴结和血道转移及TNM分期无明显关系。另外笔者还比较了cagA+Hp组和cagA-Hp组间的HIF-1α和iNOS基因的表达，发现在cagA+Hp组中，二者均呈高表达，这可能是cagA+Hp感染的胃腺癌浸润能力强的原因之一。因为HIF-1α作为一个重要的转录因子，可上调下游的靶基因，如VEGF、EPO、iNOS等的转录，参与了肿瘤的浸润和转移。iNOS可使胃黏膜内一氧化氮（NO）产生增多，在常氧条件下，NO可以通过防止HIF-1α降解来稳定它的表达，进而形成良性循环[13]。已有研究显示HIF-1α与胃癌的发生密切相关，而Hp感染是胃癌重要的始动因素，Park等[4]研究发现胃上皮细胞的中性粒细胞对Hp感染产生的炎症反应致使活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）产生，最终导致细胞损伤和进一步DNA损伤，胃上皮细胞产生的ROS能在常氧状态下导致HIF-1α的稳定表达。Suzuki和August等[14-15]进一步发现cagA+Hp感染可促发中性粒细胞更多的积聚，从而产生更多的ROS。Handa等[5]将cagA基因转染至胃上皮细胞后，发现CagA蛋白可定位于线粒体中并产生大量的ROS。综上可见cagA+Hp的感染可促进胃上皮细胞产生更多的ROS，从而参与其致炎致癌的过程，这其中也涉及到HIF-1α的通路，他们共同参与了cagA+Hp的致癌机制。

本研究初步探讨了cagA+Hp感染与胃腺癌的预后意义，发现cagA+Hp感染者的预后要差于cagA-Hp患者，这可能与其促进ROS的产生，并进一步稳定HIF-1α的表达，上调其下游基因，如iNOS，来共同参与肿瘤的发生发展过程。笔者的病例数还较少，今后仍需进行大规模的流行病调查来验证结论。

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