石 怡，李筱荣，汪建涛，刘新玲

（天津医科大学眼科中心眼底病科，天津300384）

alpha-晶体蛋白（α-crystallin）属于小分子热休克蛋白（small heat shock proteins,sHSPs）家族，其在应激反应中维持细胞必需的蛋白质构象，而且在蛋白质聚集折叠、跨膜转运、移位、细胞骨架稳定等方面均发挥重要的功能。在最近的基因芯片和蛋白质组研究中，越来越多的研究表明晶体蛋白不仅在正常视网膜，在糖尿病视网膜病变、视网膜变性等视网膜疾病中也有表达，这提示晶体蛋白在视网膜中功能的重要性[1]。视网膜新生血管是多种视网膜病变增殖期的标志性改变，对其发病机制的研究始终是眼底病研究的焦点。本研究建立小鼠氧诱导视网膜病变模型，明确视网膜新生血管的发生发展,研究alphaA-和alphaB-晶体蛋白mRNA在小鼠氧诱导视网膜病变视网膜组织中变化的规律，并行免疫荧光方法检测其在该视网膜组织中的定位分布特点，拟为进一步研究alpha-晶体蛋白在氧诱导视网膜病变中与新生血管发生之间关系的研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康清洁级C57BL/6J小鼠，购自北京中国科学院实验动物中心，天津医科大学公共卫生学院动物室繁殖健康幼鼠，雌雄不限，与哺乳母鼠共同饲养，室温保持（23±2）℃，光照 300lux，光照与黑暗12 h/12 h饲养。

1.1.2 主要试剂 医用80%氧气和20%氮气混合气体（天津市盛益源医用气体公司）。异硫氰酸葡聚糖荧光素（美国Sigma公司），alphaA-crystallin（FL-173）和 alphaB-crystallin（FL-175）)/Rabbit（美 国Santacoz公司），GoatantiRabbit IgG（H+L）-FITC（北京中杉金桥生物技术有限公司），TrizolReagent（美国Invitrogen公司）。

1.2 方法

1.2.1 氧诱导的视网膜病变小鼠模型的建立 清洁级初生C57BL/6J小鼠14窝。出生后3 d（P3）合笼饲养，实验组参照Pierce等的方法，出生后7 d（P7）时将小鼠放入氧浓度为（75±5）%的饲养箱中饲养 5 d，温度为（23±2）℃ ，氧气分析仪（BioSperix）检测并调控箱内氧气浓度，每天打开氧箱更换垫料、加食、换水、替换母鼠，出生后12 d（P12）回到正常大气环境中饲养。另设等量对照组小鼠，置于正常大气中饲养，余同实验组。

1.2.2 荧光素灌注视网膜铺片 于出生后13、17和21 d时各取实验组和对照组小鼠眼球4只，幼鼠乙醚麻醉，固定四肢，打开胸腔，暴露心脏，取异硫氰酸葡聚糖荧光素溶液1mL（50mg/L），心腔内注射。制作荧光素灌注视网膜铺片：将小鼠处死后立即摘除眼球，4%多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）固定1~3 h染色。制作视网膜铺片，于角巩膜缘剪开眼球去除前节，小心分离视网膜，放射状切开视网膜后将其平铺于载玻片上，滴少量中性树脂胶后，加盖玻片，荧光显微镜下观察血管分布和形态，数码照相机拍片记录结果。

1.2.3 Real time RT-PCR实验 各取实验组及对照组小鼠，分别收集P13、P15、P17和P21等不同时点的小鼠眼球各9只，在手术显微镜下摘取眼球，每只眼球去除角膜、晶状体、玻璃体，取出视网膜组织，提取3个视网膜组织放入1mL Trizol液（美国Invitrogen公司）中，所有样本放置在-80℃保存。采用Trizol一步法提取视网膜总RNA。取RNA进行逆转录反应，应用荧光定量PCR分析alphaA-和alphaB-晶体蛋白的相关基因mRNA表达水平。设计引物如下：alphaA-晶体蛋白上游引物：TCACCGTGAAGGTACTGGA，下游引物：TCACCGTGAAGGTACTGGAGG，扩增片段为111碱基对。alphaB-晶体蛋白上游引物：TCCACGGCAAGCACGAAG，下游引物：GACAGGGATGAAGTGATGGTGAG，扩增片段115碱基对。β-actin上游引物：AGAGGGAAATCGT GCGTGAC，下游引物：AGGCAGCTCATAGCTCTTCT CC，扩增片段116碱基对。引物委托南开大学泰达学院生物技术有限公司合成。PCR循环条件为预变性 95℃10 s，变性 95℃15 s，退火+延伸 60~95℃30 s。变性、退火、延伸重复40个循环。每一次实验重复3次。将得到的对照组和实验组CT数据分别于各自内参分析处理后，采用2-ΔΔCT方法计算各时点alphaA-和alphaB-晶体蛋白mRNA表达水平的倍数值并进行比较。

1.2.4 两种alpha-晶体蛋白免疫荧光实验 实验组与对照组分别取各组出生后13、15、17和21 d时4只新生小鼠眼球，每只眼球去除晶状体组织，后予OCT固定眼球并标记方向。切片方向平行于角膜至视乳头的矢状位，取新鲜去除晶状体眼球组织做6μm冰冻切片，5%牛血清封闭液封闭30min倾去。滴加特异性抗体alphaA-crystallin（FL-173）和alphaB-crystallin（FL-175）各 1∶50 稀释覆盖组织 4 ℃过夜孵育；转天缓至室温20 min，放置37℃孵育1 h；滴加荧光二抗 GoatantiMouse IgG（H+L）-FITC 1∶20稀释37℃孵育1 h。50%甘油缓冲液封片，荧光显微镜下观察，拍照。

1.3 统计学处理 应用SPSS13.0软件包进行统计学分析，所有计量资料均以表示。当方差齐时，组间比较采用方差分析和独立样本t检验，组内比较采用配对t检验；当方差不齐时，采用近似F检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 荧光灌注小鼠视网膜铺片 小鼠视网膜荧光灌注（高分子FITC灌注）铺片实验组与对照组相比，13 d时，对照组视网膜尚未发育完全，血管自视盘发出，向四周呈放射状均匀分布，管径较粗，分支可，尚有未成熟血管（图1-A）；实验组自视盘发出的视网膜血管充盈迂曲，分布轻度紊乱，分支减少，走行僵直，仍见残留的玻璃体动脉，中央部视网膜可见无灌注区，周边部视网膜仍可见部分小血管结构，仅有视网膜浅层存在新生血管，深层未见明显的视网膜血管形成（图1-D）。

17 d时，对照组小鼠视网膜血管基本成熟，未成熟血管消失，自视盘发出的大血管向四周呈放射状均匀分布，直至视网膜周边部，有些在周边部仍较粗，形成沿周边部视网膜走行的弓形血管，周边部尚无正常血管。全部视网膜血管分深浅两层，浅层血管呈放射状分支形态，深层血管呈多角形网状形态，两层血管通过螺旋血管互相连接（图1-B）。实验组自视盘发出的视网膜血管更加扩张、迂曲，有大量新生血管形成，血管密度更加增高，但这些新生血管网结构及分布极其紊乱，丧失了正常的放射状及多角形结构，幼鼠中可见较多的突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核，周边部可见渗漏（图1-E），而且浅层血管网及大部分深层血管网广泛闭塞。虽然与人类ROP的灌注区位于中央部视网膜、无灌注区位于周边部视网膜不同，但是新生血管的分布都是在视网膜的中周部。

21 d时，对照组较17 d时视网膜血管已完全长到周边部，其他两时间点间无明显差异（图1-C）；实验组视网膜中周边部仍可见无灌注区，但新生血管明显减少，渗漏消失（图1-F）。

2.2 real time RT-PCR结果 各组内参照β-actin的表达量较均衡。实验组alphaA-晶体蛋白mRNA的表达为先降低后升高的趋势，P17时表达量抵谷，与其他时间点比较，差异有显著统计学意义（F=220.378，P<0.01）；实验组alphaA-晶体蛋白表达在P13、P15及P21时均高于对照组，差异有显著统计学意义（t=54.223，15.947，12.998，P<0.01），实验组alphaA-晶体蛋白表达在P17时低于对照组，差异有显著统计学意义（t=7.357，P<0.01）（图 2）。

实验组alphaB-晶体蛋白mRNA的表达则呈现逐渐升高的趋势，但差异无统计学意义（F=0.895，P＞0.05），实验组不同时间两两比较，13 d时均低于17 d及21 d时，P17时低于21 d时，差异均有显著统计学意义（t=56.31，137.362，94.708，P<0.01），实验组其余时间点之间差异均无统计学意义（t=0.831，0.606，0.048，P＞0.05）；实验组 alphaB-晶体蛋白表达在13、15及17 d时均低于对照组，其中13、17 d时差异有显著统计学意义（t=14.309，31.915，12.998，P<0.01），但P15时差异无统计学意义（t=0.630，P＞0.05），在 21 d 时高于对照组，差异有统计学意义（t=3.544，P<0.05）（图 3）。

2.3 alpha-晶体蛋白在两组小鼠视网膜组之中的定位 实验组和对照组小鼠视网膜组织中，均可见alphaA-和alphaB-晶体蛋白的表达，阳性细胞主要分布在视网膜神经节细胞层、内、外核细胞层，少量表达在视网膜光感受器细胞层。这两种晶体蛋白都是在内核细胞层中不仅表达在胞膜上而且还表达在胞质中，但在外核细胞层中却仅表达在胞膜上。实验组和对照组小鼠视网膜组织中，可见alphaA-和alphaB-晶体蛋白的表达稍有不同。其在各时间点的表达稍延迟于同时间两种蛋白的mRNA的表达量。

实验组与对照组小鼠视网膜组织中，实验组alphaA-晶体蛋白的表达略多于对照组，见图4。

实验组与对照组小鼠视网膜组织中,alphaB-晶体蛋白的表达也稍有不同，呈现逐渐增强的趋势，见图5。

3 讨论

近年来，在许多动物的视网膜组织中发现了晶体蛋白的表达，而且其非晶体角色已被接受，并表达在许多组织中[2-3]。晶体蛋白表达在这些完全不同的非晶体组织中，尽管其分布不完全相同，但仍保持相同的作用机制，均可在热及代谢性应激条件下起到保护细胞的作用，而且它们通过酶抑制细胞凋亡的作用暗示这两种晶体蛋白在非晶体组织中可起到决定性作用[4-5]。

本研究中采用的是C57BL小鼠，其视网膜血管与人类有诸多相似之处，如以视盘为中心，呈放射状展开，视网膜血管网分为浅层和深层，初生时视网膜血管尚未发育完全等，因此成为研究血管发育和新生血管等的良好模型。在本实验中，我们采用的是smith法氧诱导视网膜病变的小鼠模型，新生啮齿动物P7暴露在高氧环境5 d后回到正常氧环境。在正常氧环境下视网膜相对缺氧，刺激细胞因子引起视网膜新生血管，这是一种常用的成熟的视网膜新生血管动物模型。本实验中应用FITC-Dextran灌注技术观察视网膜血管形态，验证视网膜新生血管动物模型的新生血管的发生发展过程。

本研究实验组alphaA-晶体蛋白mRNA的表达为先降低后升高的趋势，P17时表达量抵谷，P21时达峰；alphaB-晶体蛋白mRNA的表达则呈现逐渐升高的趋势,P13时均低于P17及P21时，P17时低于P21时。本研究中alphaA-晶体蛋白mRNA表达水平在形成新生血管的过程中，呈现下降趋势，在新生血管形成过程逐渐减少，可能参与抑制新生血管的形成，在新生血管形成及达到高峰后，这种晶体蛋白mRNA表达水平又明显升高，推测其对视网膜组织具有一定的保护作用，对抗缺氧对视网膜组织的损伤，在抑制细胞凋亡方面起到作用。Alpha-晶体蛋白已被证实其主要功能是结合未折叠蛋白、抑制其聚结、防止其变性降解，从而促进细胞存活[6]；一些热休克蛋白还可通过选择性抑制线粒体凋亡，从而抑制caspase-9（线粒体通路）和caspase-8（死亡受体通路）对caspase-3的激活，起到抗凋亡的作用[7，9]；另外还可通过阻止RAS的激活抑制ERKl-2的活性，从而大大减轻Ca2+诱导引起的凋亡作用[10]。

另有实验证明alpha-晶体蛋白能抑制介导细胞凋亡，在保护视网膜色素上皮细胞、光感受器细胞以及晶状体上皮细胞的损伤过程中发挥重要作用[11]。通过建立H2O2损伤视网膜神经节细胞的模型[12]，实验观察到alpha-晶体蛋白处理组细胞存活率明显高于损伤对照组，说明alpha-晶体蛋白对损伤后RGCs存活的保护作用显著，是RGCs耐受氧化损伤的保护物质。

本研究结果显示在实验组和对照组小鼠视网膜组织中，alphaA-和alphaB-晶体蛋白的定位表达，阳性细胞主要分布在视网膜神经节细胞层、内、外核细胞层，少量表达在视网膜光感受器细胞层。这两种晶体蛋白都是在内核细胞层中不仅表达在胞膜上而且还表达在胞质中，但在外核细胞层中却仅表达在胞膜上，与2003年Xi等[13]的初步研究基本一致，其发现在正常小鼠视网膜中有20种不同晶体蛋白基因的表达，其中在视网膜外核和内核层可见alpha-晶体蛋白的表达，光感受器内节可见alpha-晶体蛋白的表达。同时符合最新研究报道，其描述alphaA-晶体蛋白在早期实验性变应性色素膜炎病变的视网膜组织中增量表达[14]，提示其存在抗凋亡作用。本研究不仅再一次证明这种晶体蛋白在正常小鼠视网膜的定位表达，而且首次研究出这种晶体蛋白在氧诱导的视网膜病变小鼠中的定位表达，为进一步明确alpha-晶体蛋白与视网膜新生血管及氧诱导的视网膜病变的关系提供理论依据。

本实验研究明确在氧诱导视网膜病变小鼠视网膜组织中，alpha-晶体蛋白在视网膜组织中表达具有时空依赖性，alpha-晶体蛋白对氧诱导视网膜病变小鼠的视网膜组织可能具有保护作用，具体机制有待于进一步研究。由于经费条件限制，本实验未能通过miRNA技术消除alpha-晶体蛋白进行对照研究，拟今后实验进一步完善。本研究推测alpha-晶体蛋白对氧诱导视网膜病变小鼠的视网膜组织可能具有保护作用，其具体机制有待于进一步研究。

[1]Yaung J,Kannan R,Wawrousek E F,etal.Exacerbation of retinal degeneration in the absence of alpha-crystallin in an in vivomodel ofchemically induced hypoxia[J].Exp Eye Res,2008,86（2）：355

[2]McGreal R S,Lee Kantorow W,Chauss D C,et al.αB-crystallin/sHSP protects cytochrome c and mitochondrial function againstoxidative stress in lensand retinal cells[J].Biochim Biophys Acta,2012,1820（7）：921

[3]ZhuW,QiX,Ren S,etal.αA-crystallin in the pathogenesisand intervention ofexperimentalmurine cornealneovascularization[J].Exp EyeRes,2012,98（1）：44

[4]Wolf L,Yang Y,Wawrousek E,etal.Transcriptional regulation of mouse alpha A-crystallin gene in a 148kb Cryaa BAC and its derivates[J].BMCDev Biol,2008,19（8）：88

[5]RaoN A,Saraswathy S,Pararajasegaram G,etal.Smallheatshock proteinαA-crystallin prevents photoreceptor degeneration in experimentalautoimmuneuveitis[J].PLoSOne,2012,7（3）：e33582

[6]Ahmad M F,Ranman B,Ramakrishna T,eta1.Effectofphosphorylation on alpha B-crystallin：differences in stability,subunit exchange and chaperone activity of homo and mixed oligomers of alphaB-crystallin and its phosphory-lation-mimickingmutant[J].J MolBiol,2008,375（4）：1040

[7]Andley UP,Song Z,Wawrousek E F,eta1.Differentialprotective activity of alpha A-and alpha B-crystallin in lens epithelial cells[J].JBiolChem,2000,275（47）：36823

[8]KamradtM C,Chen F,Sam S,eta1.The smallheatshock protein alpha B-crystallin negatively regulates apoptosis during myogenic differentiation by inhibiting caspase-3 activation[J].JBiol Chem,2002,277（41）：38731

[9]Kamradt M C,Chen F,Cryns V L.The small heat shock protein alphaB-crystallin negatively regulates cytochromec-and caspase-8-dependent activation of caspase-3 by inhibiting its autoproteolyticmaturation[J].JBiolChem,2001,276（191）：16059

[10]Li D W,Liu J P,Mao Y W,et a1.Calcium-activated RAF／MEK／ERK signaling pathwaymediates p53-dependent apoptosis and is abrogated by alphaB-crystallin through inhibition of RAS activation[J].MolBiolCell,2005,16（9）：4437

[11]Maddala R,Rao V P.Alpha-crystallin localizes to the leading edges ofmigrating lensepithelial cells[J].Exp Cell Res,2005,306（1）：203

[12]王晓芹，王一.alpha-晶体蛋白干预大鼠RGCs过氧化损伤作用实验研究[J].重庆医学，2006，10，35（19）：1764

[13]Xi J,Farjo R,Yoshida S,et al.A comprehensive analysis of the expression of crystallins inmouse retina[J].Mol Vis,2003,28（9）：410

[14]Rao N A,Saraswathy S,Wu G S,et al.Elevated retina-specific expression of the smallheatshock protein,alphaA-crystallin,isassociated with photoreceptor protection in experimental uveitis[J].InvestOphthalmolVisSci,2008,49（3）：1161