刘 铜， 侯巨梅， 陈 捷， 荆 晶， 王玉莹， 左豫虎＊

（1.黑龙江八一农垦大学农学院，大庆 163319；2.上海交通大学农业与生物学院，上海 200240）

由新月弯孢［Curvularia lunata（Wakker）Boed］引起的玉米弯孢叶斑病已成为玉米上一种重要的叶部病害，对我国玉米生产造成了严重的损失［1－4］。目前对该菌研究主要集中在致病性分化与变异和致病机理等方面［5－6］。在对致病机理研究过程中，利用突变体或同源克隆方法分离与克隆了一些致病相关基因，需要进行基因功能的研究。遗传转化体系是对基因功能研究的主要方法之一，然而目前玉米弯孢叶斑病菌遗传转化体系除了ATMT外［7］，并没有对其他的遗传转化体系进行系统的研究，特别是PEG介导的原生质体转化。

PEG介导的原生质体转化体系是利用聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）作为原生质体的诱导剂，它可使细胞膜之间或外源DNA与膜之间形成分子桥，促使相互间的接触和粘连，并可通过改变细胞膜表面的电荷，引起细胞膜通透性的改变，从而可以使外源DNA进入原生质体，随机插入并整合到染色体上，完成基因置换和互补。由于该方法具有操作相对简便、DNA分子易于进入、转化子纯合性好等优点，它已在丝状真菌基因功能研究中发挥着重要作用［8］。因此本研究拟建立玉米弯孢叶斑病菌原生质体遗传转化体系，为开展该菌致病相关基因克隆和基因功能研究提供一种手段。

1 材料与方法

1.1 菌株与质粒

玉米弯孢叶斑病菌（C.lunata）作为转化受体。质粒pV2作为转化供体，它具有潮霉素抗性基因（HyB）标记和氨苄青霉素抗性基因（Amp）标记，有HindⅢ等多种限制酶的单酶切位点。

1.2 培养基及缓冲液

1.2.1 菌丝培养基

马铃薯200g，葡萄糖20g，酵母膏15g。

1.2.2 原生质固体再生培养基

NaNO32g，K2HPO41g，KCl 52g，MgSO4·7H2O 0.05g，FeSO4·7H2O 10mg，蔗糖20g，琼脂18g。

1.2.3 酶解缓冲液

pH 5.6柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲液配制的0.7mol／L KCl溶液。

1.3 主要试剂

溶壁酶购自广州微生物所；纤维素酶、崩溃酶和蜗牛酶均购自Sigma公司；RnaseA（浓度为10mg／mL）、氨苄青霉素、Tris饱和酚购自北京鼎国生物技术有限责任公司；限制性内切酶HindⅢ购自北京经科宏达；Southern blotting试剂盒购自美国GE Healthcare公司；氯仿、异戊醇、琼脂粉等其他常用试剂均购自上海国药集团化学试剂有限公司。

1.4 质粒提取

取Amp抗生素生长到对数生长期的细菌培养液于1.5mL 微量 离 心 管 中，8 000r／min 离 心1min，留沉淀提取质粒，具体操作参照试剂盒方法。

1.5 原生质体制备

新月弯孢于PDA平板上28℃培养7d，加入无菌水用灭菌钩刮下孢子使其混匀，调整孢子悬浮液的浓度达到106cfu／mL。取孢子悬浮液1mL加入到100mL的菌丝培养基中，置于30℃、120r／min的摇床上振荡培养20h，取出后用三层擦镜纸过滤，并用酶解缓冲液冲洗菌丝，收集菌丝体。

将上述得到的菌丝按1∶10（W／V）加至50mL离心管酶液中，置于30℃、100r／min的水浴摇床上酶解。取酶解悬浮液滴于血球计数板上，置于显微镜下观察计算，得出原生质的产量。然后用3层擦镜纸过滤原生质体，滤液在4℃、4 000r／min离心15min，弃上清，沉淀用 Wash buffer 1（0.7mol／L KCl，50mmol／L CaCl2）清洗2次；然后加入适量Wash buffer 2（1.0mol／L 甘露醇，10mmol／L Tris－HCl，pH 7.5，50mmol／L CaCl2）溶液，混匀，调原生质体浓度至107cfu／mL待用。

细胞壁降解酶对原生质体制备的影响：以1%溶壁酶、1%溶壁酶＋1%崩溃酶、1%溶壁酶＋1%纤维素酶、1%溶壁酶＋1%纤维素酶＋1%蜗牛酶、1%溶壁酶＋1%崩溃酶＋1%纤维素酶5种不同酶系组合，比较不同酶系统对原生质制备的影响，确定酶解菌丝细胞壁的最佳酶系统。其他固定条件为：酶解溶液为pH 5.6柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲液，菌龄为20h，酶解温度为30℃，酶解时间为4h。

1.6 原生质体再生

取出酶解原生质体用三层擦镜纸过滤，滤液于4℃、4 000r／min离心15min，弃上清，沉淀用Wash buffer 1清洗2次；将获得的原生质体稀释到102cfu／mL，取1mL含原生质体的液体培养基与20mL热融并冷却至45℃的含相应原生质体固体再生培养基混合，并迅速轻轻摇动，使原生质体均匀分布于培养基中，待凝固后封口，在25℃倒置培养5d，对形成的菌落数计数（A），以不含稳渗剂再生培养基作对照（B），重复3次，求平均值，计算再生率。再生率公式：再生率（%）＝（A－B）×100／总原生质体数。

1.7 PEG介导的原生质体转化

在50mL离心管中加入180μL原生质体，在冰上放置20min后，加入质粒20μL（20μg），冰浴30min后缓慢向管中加入300μL 40%PEG，分3次加完，冰浴20min；然后将离心管取出，在28℃下放置20min。最后将200μL混合物平铺于含200μg／mL潮霉素B原生质体固体再生培养基上，在28℃下培养7d，将能够抗潮霉素的菌落转移到预先倒好的含有潮霉素的固体PDA培养基上进行二次筛选，得到的菌株即为突变株。

1.8 DNA提取与PCR检测

CTAB法提取基因组DNA，其方法参见文献［9］。PCR反应体系（25μL）：Premix Taq 12.5μL，DNA模板1μL，引物 hyg－F：5′－CGACAGCGTCTCCGACCTGA－3′和 hyg－R：5′－CGCCCAAGCTGCATCATCGAA－3′各1μL，ddH2O 9.5μL。PCR 扩增条件：94 ℃5min，94℃1min，55℃45s，72℃1min，共30个循环；72℃5min；1.0%琼脂糖电泳检测。

1.9 Southern blotting分析

Southern blotting分析根据Southern blotting试剂盒操作说明进行。采用HindⅢ限制性内切酶对基因组进行酶切，300μL酶切体系中含20μg DNA，8μL 限制性内切酶，30μL 10×Buffer。37℃，酶切过夜。Southern杂交温度为55℃。以潮霉素基因片段（811bp）为探针进行标记。

2 结果与分析

2.1 原生质体制备与再生

新月弯孢菌丝被加入裂解酶液后，最初1～2h无原生质体释放，但菌丝出现了断裂，顶端聚集膨大，随着裂解时间的延长，菌丝的顶端开始释放原生质体；在释放中期，菌丝以断裂为主，释放不规则圆形的原生质体，释放的高峰在3～4h之间，在大约5h后，基本释放完成。不同组成的酶系影响了原生质体产量，用溶壁酶与另外3种酶相互组合进行菌丝的破壁处理，均可产生一定量的原生质体，其效果优于单一溶壁酶。当1%溶壁酶＋1%蜗牛酶＋1%纤维素混合酶可以产生原生质体6.78×108cfu／mL，再生率达27%。其结果如表1。

表1 酶系对原生质体释放的影响

2.2 转化子的获得

经PEG转化后，在再生培养基上获得新月弯孢再生菌落，将其转接到含200μg／mL潮霉素的PDA培养基进行二次筛选，然后将稳定的转化子在不含潮霉素PDA培养基上继续传代5次后，再移入含200μg／mL潮霉素的PDA培养基，获得16个能够正常生长转化子，初步确定为稳定的转化子。

2.3 转化子PCR

随机挑取5个稳定转化子，分别提取它们的总DNA，根据已知潮霉素磷酸转移酶基因hyg－F和hyg－R引物进行了PCR检测。5个突变株均能扩增出潮霉素磷酸转移酶基因的谱带（811bp）（图1），表明质粒可能成功插入突变株中，而出发菌没有扩增出潮霉素磷酸转移酶基因的谱带，证明在出发菌中不存在潮霉素磷酸转移酶基因的序列，没有质粒的整合。

图1 对随机挑取的5个转化子中潮霉素基因分析

2.4 Southern blotting检测

为了进一步确定质粒pV2已成功插入突变株中，以潮霉素基因片段（811bp）为探针对所获得5个转化子进行Southern blotting检测，发现5个转化子均出现了条带，结果进一步表明质粒pV2已经插入新月弯孢基因组中（图2）。

图2 转化子Southern blotting分析

3 讨论

PEG介导的转化所采用的材料是原生质体，所以原生质体制备成为遗传转化过程中的一个重要环节，原生质体质量的好坏直接影响着转化试验的成功与否，它是开展PEG转化工作的关键［10］。制备高质量的原生质体，需选择适合的溶菌酶，对受体菌的菌龄、酶解时间、酶解温度等均要进行摸索［11－12］。王赓等［13］在对新月弯孢的原生质体制备过程中发现，在30℃条件下，将培养16h的弯孢菌丝用溶壁酶和纤维酶的混合酶液酶解4h，原生质体释放量达到6.0×106个／mL，原生质体再生率为2.7%。黄世文等［14］对新月弯孢原生质体的制备过程中一些影响因素进行了系统的分析，发现培养18h的菌丝，以0.7mol／L KCl作为渗透压稳定剂，30℃下经过2%溶壁酶＋4%纤维素酶混合酶液（pH5.8）酶解4h，原生质体在静止条件下最大释放量达到1.7×106个／mL，再生率为0.76%。另有研究报道，制备原生质体一般要求使用新鲜萌发孢子，用冷藏过的细胞制备原生质体时，转化效率明显下降［15］。因此，获得大量原生质体是成功转化的关键。本研究在前人研究的基础上，重点筛选了裂解酶种类，提高了对菌丝的裂解，获得了更多的原生质体，增加转化率。

本研究成功运用PEG介导的玉米弯孢霉叶斑病菌的遗传转化，以完整的质粒随机插入受体菌基因组中，从而可以导致相应功能的丧失或减弱或某些调控基因表达增强或带上选择标记，有利于对功能基因的克隆与定位，同时也有利于DNA的交换，为开展玉米弯孢叶斑病菌基因功能研究奠定了基础。

［1］ 戴法超，高卫东，王晓鸣，等.玉米弯孢菌叶斑病的初步研究简报［J］.植物保护，1996，22（4）：36－37.

［2］ 戴法超，王晓鸣，朱振东，等.玉米弯孢菌叶斑病研究［J］.植物病理学报，1998，28（2）：123－129.

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