高锡强，傅春燕，薛 婧，王 卫，陈 霆，魏 强

(中国医学科学院医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京100021)

SIVmac239病毒经不同途径感染恒河猴急性期CD4+T细胞数量与其细胞表面CD95表达量的变化关系

高锡强，傅春燕，薛 婧，王 卫，陈 霆，魏 强

(中国医学科学院医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京100021)

目的 研究SIVmac239病毒分别通过直肠(rectal infection:IR)及静脉(intravenous infection:IV)感染恒河猴，在感染急性期外周血CD4+T细胞数量与其细胞表面的死亡受体(CD95)表达量之间的变化关系。方法 将SIVmac239经直肠及静脉途径各感染14只恒河猴。监测病毒载量、CD4+T淋巴细胞数量及CD4+/CD8+比值的变化，从而明确感染。同时，在感染急性期内9个时间点采集静脉血，并利用流式细胞术分析CD4+T细胞表面CD95的表达量。结果 静脉组恒河猴CD95表达量于第2天开始升高，第7天达到最高，同时CD4+T淋巴细胞数降到最低。直肠组恒河猴也于感染后第2天开始升高，但第10天才达到最高值，CD4+T淋巴细胞数于第17天降到最低。同静脉组相比，直肠组CD95表达量增高及CD4+T细胞数降低均较晚出现，且其CD4+T细胞数量降至最低晚于CD95表达量达到峰值一周后出现。结论 SIVmac239经直肠及静脉感染恒河猴后，伴随CD4+T细胞表面CD95表达的升高，CD4+T细胞数量逐渐下降。但不同感染途径对CD4+T细胞表面CD95的表达量与CD4+T淋巴细胞数的变化不尽相同，这可能由于不同感染途径造成CD95在感染急性期CD4+T细胞数量降低中发挥的作用不同。

SIV;CD4+T细胞;病毒载量;CD95;恒河猴

HIV/SIV感染途径的不同会影响艾滋病的预后和疾病进程。CD4+T细胞数量的降低是衡量艾滋病疾病进程的重要指标，病毒感染后细胞表面死亡受体CD95的表达升高能够介导细胞发生凋亡从而造成细胞数量的降低［1－3］。因此，利用非人灵长类动物模型了解不同感染途径对急性期恒河猴体内CD4+T细胞数量及其细胞表面CD95表达量之间的变化关系，将为阐明经不同途径感染艾滋病的发病机理以及疫苗开发等提供重要的参考［4］。

1 材料和方法

1.1 实验动物

本实验选用28只健康的中国恒河猴，购自北京协尔鑫生物资源研究所。动物饲养及相关实验在生物安全三级实验室中进行。本研究已经通过相关伦理审查委员会批准，使用动物合格证号为ILAS－VL－2011－002，动物饲养以及样品采集均遵照生物安全相关要求。实验组随机分为2组，静脉感染组(IV)和直肠感染组(IR)，每组恒河猴雌雄各半。

1.2 攻毒方式

攻毒前一天晚上禁食，第2天肌内注射复方氯氨酮麻醉。静脉组(IV)用105TCID50的SIVmac239经静脉感染14只中国恒河猴。直肠组(IR)恒河猴为俯卧位以保证直肠黏膜充分暴露，缓慢将105TCID50的SIVmac239注入肛窦处，静置30 min。

1.3 样品采集和处理

静脉组样品采样时间点分别为第 0、2、7、10、17、24、31、52 和 66 d，直肠组采样时间分别 0、3、8、10、17、24、31、52 和 66 d。在每个时间点采集 5mL静脉抗凝血。其中，50 μL用于检测血常规，50 μL用于T淋巴细胞亚群分析。

1.4 CD3+、CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群分析

使用三种单克隆抗体 CD3－PerCP、CD4－FITC 和CD8－PE标记新鲜的EDTA抗凝的外周血，室温避光作用15 min后洗涤2次，细胞重悬于400 μL的PBS中，流式细胞仪分析并计数。

1.5 CD4+T淋巴细胞表面CD95表达量的检测

使用CD95－APC标记新鲜的EDTA抗凝的外周血，室温避光作用15 min后洗涤2次，细胞重悬于400 μL的PBS中，流式细胞仪检测并分析 CD4+T细胞表面CD95的阳性百分比。

1.6 外周血病毒载量的检测［5］

抗凝全血离心后取上清200 μL，利用 Trizol法提取血浆病毒RNA，荧光实时定量 RT－PCR法测定SIVmac239 RNA载量。

1.7 数据分析

流式数据使用FlowJo进行分析，作图及统计分析使用Graphpad prism和SPSS软件。

2 结果

2.1 CD4+T细胞表面CD95表达量的确定

将随机抽取五只恒河猴的外周血混合，用四种单克隆抗体 CD3－PerCP、CD4－FITC、CD8－PE，CD95－APC标记外周血单个核细胞。如图1所示，R1表示外周血单个核细胞中的淋巴细胞群，R2和R3分别表示CD4+T细胞(42.8%)和CD8+T细胞(18.2%)，M1则表示 CD4+T细胞表面 CD95的阳性百分比为46%。本研究用该方法检测不同时间点外周血中CD4+T细胞表面CD95表达量的变化。

2.2 SIVmac239静脉及直肠感染恒河猴外周血病毒载量结果

如图2所示，SIVmac239经静脉及直肠感染恒河猴后均出现典型的艾滋病发病的病毒载量变化，但静脉组的血浆病毒载量明显高于直肠组。随着疾病进程的发展，进入到平台期以后，静脉组的病毒载量略高于直肠组。两个感染组均于感染后第10天达到血浆病毒载量的高峰值，其中，静脉组峰值达到6×106拷贝/mL，直肠组峰值达到2×106拷贝/mL，说明这两种感染途径都是HIV传播的有效途径。此外，静脉组(第2天开始上升)病毒载量上升的时间明显早于直肠组(第3天开始上升)，这可能是由于静脉感染途径更易于感染血液中的CD4+T淋巴细胞，而直肠组在黏膜部位的靶细胞相对较少，并存在抗SIV感染的局部黏膜免疫应答，因此在血液中检测到病毒载量的时间相对滞后。

图1 外周血CD4+T细胞表面CD95的表达量Fig.1 CD95 expression on the surface of peripheral blood CD4+T lymphocytes

图2 静脉及直肠感染恒河猴外周血病毒载量变化Fig.2 Changes of peripheral blood viral load from rhesus monkeys infected with SIVmac239 intrarectally or intravenously

2.3 SIVmac239静脉及直肠感染恒河猴外周血CD4+T淋巴细胞数量的动态变化

静脉及直肠感染 SIV后，恒河猴体内 CD4+T淋巴细胞绝对数都是先降低然后逐渐恢复至正常水平。同直肠组相比，静脉组于静脉感染后48 h CD4+T淋巴细胞数急剧升高达1 064个/μL，随后迅速降低，直到第7天降至最低(441个/μL)。直肠组CD4+T淋巴细胞数于第17天降至最低为450个/μL，其降到最低点的时间比静脉组推迟了10 d左右(图3)。

2.4 SIVmac239静脉及直肠感染恒河猴外周血中CD4+/CD8+T淋巴细胞比值的变化

如图4所示，流式细胞术检测了静脉及直肠感染恒河猴外周血中CD4+/CD8+T淋巴细胞比例的变化。静脉组在感染后CD4+/CD8+比值就急剧降低，第17天比例降至最低(小于1)。相比之下，直肠组CD4+/CD8+比值先升高(最高达3.37)，然后急剧下降，第24天降至最低(小于1)。

图3 静脉及直肠感染恒河猴外周血CD4+T淋巴细胞数量变化Fig.3 Changes of peripheral blood CD4+T lymphocytes in SIVmac239－infected rhesus monkeys intrarectally or intravenously

图4 恒河猴外周血中CD4+/CD8+T淋巴细胞比值的变化Fig.4 Changes of peripheral blood CD4+/CD8+T lymphocyte ratio

2.5 SIVmac239经静脉及直肠感染CD4+T淋巴细胞表面CD95表达量的变化

SIVmac239经静脉及直肠感染恒河猴后病毒载量、CD4+T淋巴细胞数和CD4+/CD8+比值的变化均表明恒河猴已经成功感染了SIV。于是，我们用流式细胞仪检测了CD4+T淋巴细胞表面CD95表达量的变化，即静脉及直肠感染后CD95表达量均急剧升高然后恢复至正常水平。静脉组于感染后第7天CD95表达百分比高达97%，直肠组则于感染后第10天比例达到69%。可见，CD95的表达量在感染的早期变化较大(主要发生于感染后前20 d内)，且静脉组CD95的表达量明显高于直肠组(图5)。

图5 CD4+T淋巴细胞表面CD95表达量的变化Fig.5 Changes of CD95 expression on the surface of CD4+T lymphocytes

2.6 静脉及直肠感染对CD4+T细胞表面CD95表达量与其绝对数的影响

图6为不同时间点CD4+T细胞表面CD95表达量与CD4+T细胞数进行了比较分析。两种途径感染后的30 d之内是发病的急性期，感染后第2天起CD4+T细胞表面CD95的表达量均有所增加，且静脉组CD95表达百分比增加的幅度明显高于直肠组。同直肠组相比，静脉组CD95表达量于第七天达到高峰，同时CD4+T淋巴细胞数降到最低。直肠组则于第10天达到高峰，与静脉组相比两者峰值相差29.5。此外，直肠组CD95表达量增高及CD4+T细胞数降低均较晚出现，且其CD4+T细胞数量的最低值晚于CD95表达量达到峰值1周后出现。

图6 CD4+T淋巴细胞数与其表面CD95表达量的变化Fig.6 The change of CD4+T lymphocytes and CD95 expression from peripheral blood of SIVmac239－infected rhesus monkeys

3 讨论

SIV/恒河猴模型是艾滋病研究应用最为广泛的非人灵长类动物模型。目前，SIV/恒河猴模型主要有印度源恒河猴和中国源恒河猴。鉴于SIV感染印度源恒河猴的疾病病程发展较快，与HIV感染的疾病进程不同，因此，中国源恒河猴更能较好的作为艾滋病的动物模型［6］。

死亡受体 CD95(AP0－1/Fas－)是肿瘤坏死因子(TNF)/神经生长因子(NGF)受体超家族成员，为I型跨膜糖蛋白，胞外段含有157个氨基酸，其中含有两个功能域:一个是 N端的配体结合前聚集域(PLAD)，具有在结合配体前即促使Fas自身三聚体化作用;另一个是紧接的配体结合域(ligand binding domain，LBD)，具有结合 Fas配体的作用，从而诱导细胞发生凋亡［7－9］。HIV/SIV感染的一个显著临床特征是CD4+T淋巴细胞的数量降低。CD95在正常细胞表面表达量恒定，其表达量升高时可以介导细胞发生凋亡［10，11］。

我们的研究结果表明经静脉及直肠感染SIV后，CD95的表达量在急性期早期有一短暂而急剧的升高过程，这可能是其介导急性期CD4+T淋巴细胞因凋亡而导致数量降低的原因之一，急性期后期可能是由病毒的结构蛋白等其他诱导因素所致。除此以外，静脉组CD95的表达量达到高峰时CD4+T淋巴细胞数量降到最低，但直肠组 CD95的表达量达到高峰后的7 d CD4+T淋巴细胞数量才降到最低。这可能是由于静脉感染途径病毒直接攻击外周血CD4+T淋巴细胞，外界病原刺激致使CD95表达增高直接导致了CD4+T细胞的大量死亡，而直肠组病毒攻击粘膜靶细胞，发挥局部黏膜免疫应答，因此即使病原刺激CD95表达增加但由于淋巴循环等其他因素致使CD4+T细胞的死亡稍晚出现。关于HIV/SIV患者中CD95介导CD4+T细胞凋亡的详细机制有待于进一步的深入研究。

［1］Poonia B，Pauza CD，Salvato MS.Role of the Fas/FasL pathway in HIV or SIV disease［J］.Retrovirology.2009，15(6):91－98.

［2］Priceputu E，Rodrigue I，Chrobak P，et al.The Nef－mediated AIDS－like disease of CD4C / human immunodeficiency virus transgenic mice is associated with increased Fas /FasL expression on T cells and T－cell death but is not prevented in Fas－，FasL－，tumor necrosis factor receptor 1－，or interleukin－1beta－converting enzyme－deficient or Bcl2－expressing transgenic mice［J］. J Virol. 2005，79(10): 6377－6391.

［3］Bäumler CB，Böhler T，Herr I，et al. Activation of the CD95(APO－1 /Fas)system in T cells from human immunodeficiency virus type－1－infected children［J］. Blood. 1996，88 (5): 1741－1746.

［4］Cummins NW， Badley AD. Mechanisms of HIV－associated lymphocyte apoptosis［J］. Cell Death Dis. 2010，11(1): 99.

［5］王卫，丛喆，刘浩，等. 体内CD8 + T 细胞剔除对无症状期SHIV 感染猴的影响［J］. 中国比较医学杂志. 2011，21(4):2－5.

［6］Wambua D， Henderson R， Solomon C， et al. SIV－infected Chinese－origin rhesus macaques express specific MHC class I alleles in either elite controllers or normal progressors［J］. J Med Primatol. 2011 ，40(4): 244－247.

［7］Sasaki Y，Ami Y，Nakasone T，et al. Induction of CD95 ligand expression on T lymphocytes and B lymphocytes and its contribution to apoptosis of CD95－up－regulated CD4+T lymphocytes in macaques by infection with a pathogenic simian/human immunodeficiency virus［J］.Clin Exp Immunol.2000，122(3):381－389.

［8］Aries SP，Schaaf B，Müller C，et al.Fas(CD95)expression on CD4+T cells from HIV－infected patients increases with disease progression［J］.J Mol Med(Berl).1995，73(12):591－593.

［9］Mitra D，Steiner M，Lynch DH，et al.HIV－1 upregulates Fas ligand expression in CD4+T cells in vitro and in vivo:association with Fas－mediated apoptosis and modulation by aurintricarboxylic acid［J］.Immunology.1996，87(4):581－585.

［10］Silvestris F，Cafforio P，Frassanito MA，et al.Overexpression of Fas antigen on T cells in advanced HIV－1 infection:differential ligation constantly induces apoptosis［J］.AIDS.1996，10(2):131－141.

［11］McCloskey TW，Oyaizu N，Bakshi S，et al.CD95 expression and apoptosis during pediatric HIV infection:early upregulation of CD95 expression［J］.Clin Immunol Immunopathol.1998，87(1):33－41.

CD95 Expressed on the Surface of CD4+T Cells During the Acute Phase of SIVmac239-Infection in Rhesus Monkeys by Different Routes

GAO Xi－qiang，FU Chun－yan，XUE Jing，WANG Wei，CHEN Ting，WEI Qiang
(Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine，Ministry of Health;Institute of Medical Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences;Key Laboratory of Human Diseases Animal Models，State administration of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100021，China)

Objective To study the expression of death receptor(CD95)on the surface of peripheral blood CD4+T cells and the CD4+T cell numbers during the acute phase in SIVmac239 virus－infected rhesus monkeys challenged by rectal(rectal infection:IR)and intravenous(intravenous infection:IV)routes，respectively.Methods Fourteen rhesus monkeys were challenged with SIVmac239 intrarectally or intravenously.Infection was determined by monitoring the viral load，CD4+T lymphocyte number and CD4+/CD8+ratio.Flow cytometry analysis was used to assess the CD95 expressionon the surface of CD4+T cells at nine time points during the acute－phase infection.Results In the intravenous infection group，CD95 expression on the CD4+T cells began to increase on the next day after infection，and reached the peak value on the 7th day，meanwhile the CD4+T lymphocyte number was declined to the lowest point.In the rectal infection group it also began to rise on the following day after infection and the CD95 expression reached the peak value at 10 days after infection，but the number of CD4+T cells was reduced to the lowest point until the 17th day.Compared with the intravenous infection，the peak value of CD95 expression and the lowest point of CD4+T cell number appeared later in the IR group，and the peak value of CD95 expression occurred a week earlier to the lowest point of CD4+T cells.Conclusions CD95 expression of the CD4+T cells is increased and the amount of CD4+T cells is decreased in SIVmac 239－infected rhesus monkeys challenged intrarectally or intravenously.Our results show that CD95 expressed on the surface of CD4+T cells vary in the SIVmac 239－infected rhesus monkeys.It may be due to the different effects of CD95 during the acute phase infection induced by different routes.

SIV;CD4+T lymphocyte;viral load;CD95;Rhesus monkeys

R33;R734

A

1671－7856(2012)10－0014－05

10.3969.j.issn.1671.7856.2012.010.004

2012－09－25

“十二·五”国家科技重大专项(2012ZX10004－501)。

高锡强(1982－)，男，研究生，比较医学专业。

魏强，教授，博士生导师，研究方向:医学实验动物病毒学。Email:weiqiang0430@sohu.com。