徐庆阳，孙家凯，吴晓娇，王晶，谢希贤，陈宁

(天津科技大学生物工程学院，工业发酵微生物教育部重点实验室，天津，300457)

有机氮源对谷氨酸棒杆菌发酵L-缬氨酸的影响*

徐庆阳，孙家凯，吴晓娇，王晶，谢希贤，陈宁

(天津科技大学生物工程学院，工业发酵微生物教育部重点实验室，天津，300457)

以L-缬氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌XV0505为供试菌株，研究有机氮源对L-缬氨酸发酵的影响，确定了玉米浆代替豆饼水解液作为有机氮源的发酵工艺，降低了发酵成本;考察不同玉米浆浓度对谷氨酸棒杆菌XV0505发酵生产L-缬氨酸过程中生物量、耗糖速率、L-缬氨酸产量、副产物积累及氨消耗等方面影响，确定了玉米浆的适宜添加浓度;考察了玉米浆与生物素不同配比对L-缬氨酸分批发酵过程的影响，确定了最适生物素添加浓度。与原工艺相比，新工艺的菌体生物量及产酸提高了13.2%和18.5%。

有机氮源，L-缬氨酸，玉米浆，生物素

L-缬氨酸属于分支链氨基酸，是人体必需氨基酸之一，除用于一般营养型素膳外，还大量用于配制治疗型特种氨基酸输液、合成食品抗氧化剂和多肽药物，在医学研究和治疗中的生理学作用日益受到重视[1］。目前微生物发酵法是大规模生产L-缬氨酸的首选技术。现常用L-缬氨酸生产菌大多由谷氨酸棒杆菌、黏质赛氏杆菌、乳糖发酵短杆菌及大肠杆菌选育而来[2］。利用微生物发酵法生产L-缬氨酸具有原料成本低、反应条件温和及可大规模生产等优点，是一种非常经济的生产方法[3］。因此，选育适合工业化生产的优良菌种以及获得最佳发酵工艺条件均是提高L-缬氨酸发酵水平的有效途径。

氮源是合成菌体蛋白质、核酸等含氮物质和合成L-缬氨酸氨基的来源，其中无机氮源是微生物生长的速效氮源，而有机氮源能够为菌体生长提供氮元素及必需的生长因子，选择合适的有机氮源对提高L-缬氨酸产量以及降低原料成本具有重大意义[4］。本文研究了不同有机氮源对谷氨酸棒杆菌XV0505菌株发酵生产L-缬氨酸的影响，确定了L-缬氨酸发酵过程中玉米浆代替豆饼水解液作为有机氮源的发酵工艺，在降低原料成本的同时，提高了L-缬氨酸的产量。

1 材料和方法

1.1 菌种

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)XV0505(Leu-+Ile-+2-TAr+α-ABr+SGr)，天津科技大学代谢工程研究室保藏菌种。

1.2 培养基

种子培养基(g/L):葡萄糖30，酵母粉 10，豆饼水解液 10 mL，(NH4)2SO410，MgSO4·7H2O 5，KH2PO41，pH 7.0～7.2，0.75×105Pa灭菌15 min。

发酵培养基(g/L):葡萄糖 80，(NH4)2SO44，MgSO4·7H2O 1，KH2PO42，玉米浆 35 mL，FeSO4·7H2O 100 mg，Ile 0.06，Leu 0.2，Met 0.5，VB1200 μg，生物素100 μg，pH 7.0～7.2，0.75×105Pa灭菌 15 min。

1.3 培养方法

活化斜面培养:32℃恒温培养24 h。

5 L种子罐(上海保兴)培养:吸取适量无菌生理盐水于3支活化斜面中，将所有菌悬液接入装5 L种子罐中，初始装液量为3 L，初始通气量3 L/min;搅拌转速300～500 r/min;通过自动流加氨水控制pH 7.0;培养温度37℃;以泡敌消泡;待种子培养液OD600值在10～20时，按10%接种量接入发酵培养基中。

5 L发酵罐培养:按10%接种量将种子液接入5 L发酵罐中;初始通气量2 L/min;搅拌转速500～800 r/min;通过自动流加氨水控制 pH 7.0;培养温度32℃;以泡敌消泡;发酵过程中残糖降至一定值时，将80%葡萄糖溶液连续流加入培养基中。

1.4 分析方法

菌体生物量[5］:以菌体干重表示。取10 mL发酵液，10000 r/min离心20 min，将菌体用蒸馏水洗涤2次后置于真空干燥箱中80℃干燥至恒重，用分析天平称重。本文中所有数据均为3组平行实验的平均值。

L-缬氨酸含量:采用高效液相分析系统测定。色谱分离条件:Agilent C18(15 mm×4.6 mm，3.5 μm)，2，4-二硝基氟苯柱前衍生测定，乙腈与NaAc溶液进行梯度洗脱，柱温33℃，流动相流量1 mL/min，检测波长360 nm。

乳酸及NH4+浓度:采用 BioProfile 300A Nova(Nova Biomedical，USA)生化分析仪测定。

2 结果与讨论

2.1 不同有机氮源对L-缬氨酸发酵的影响

分别选取酵母膏、蛋白胨、酵母粉、豆饼水解液、玉米浆作为L-缬氨酸发酵的初始有机氮源，添加量为2 g/L(后两者按20 mL/L计)，在5 L发酵罐上进行补料分批发酵60 h，结果如图1所示。

图1 不同有机氮源对L-缬氨酸发酵的影响

由图1可看出，不同有机氮源发酵时菌体的生物量和产酸有明显差异。由图1-A可以看出，使用玉米浆作为有机氮源时，菌体延滞期明显缩短，4 h即进入对数生长期，18 h进入稳定期，菌体在35 h达到最大生物量27.2 g/L，且在整个发酵过程中菌体没有发生明显衰退。而原始发酵工艺采用豆饼水解液作为有机氮源发酵时菌体的生长趋势与前者大致相当，其最大生物量为25.7 g/L，但菌体在50 h后发生明显衰退。而酵母粉与蛋白胨作为有机氮源时，菌体的延滞期明显延长，且菌体的最大生物量均明显减小，分别为19.9 g/L和17.1 g/L，分别较以玉米浆作为有机氮源发酵时低26.3%和37.1%。就产酸而言，由图1-B可知，使用玉米浆和豆饼水解液发酵时L-缬氨酸产量为45.2 g/L和41.7 g/L，酵母膏产量较前两者低，为32.5 g/L，而使用酵母粉与蛋白胨发酵时产酸明显降低，两者产量仅为27.7 g/L和25.1 g/L。

由图1可知，使用玉米浆作为有机氮源，对菌体生长和产酸最为有利，这是因为玉米浆是一种用亚硫酸浸泡玉米而得的浸泡水浓缩物，含有丰富的氨基酸、核酸、维生素、无机盐等[6］，可以缩短菌体代谢过程，加快菌体生长，延长产酸期从而提高产率。此外，原始发酵工艺采用豆饼水解液虽然同样能够得到较高的菌体生物量及L-缬氨酸产量，但是其后期发酵无力，菌体衰退较快，另外，考虑到原料成本原因，确定玉米浆作为L-缬氨酸发酵的有机氮源。

2.2 玉米浆添加浓度对L-缬氨酸发酵的影响

图2为不同玉米浆浓度发酵时菌体耗糖速率变化曲线以及生物量、L-缬氨酸产量、副产物积累图。由图2可知，在发酵过程中，不同玉米浆浓度发酵时耗糖速率、菌体生物量、L-缬氨酸产量以及副产物积累均存在显著差异。随着玉米浆浓度的增加耗糖速率明显增加(图2-A)，但玉米浆添加浓度为35 mL/L与45 mL/L最大耗糖速率差异较小，分别为7.5 g/(L·h)和7.9 g/(L·h)，虽然前者达到最大耗糖速率较后者有所推迟，但前者在发酵中后期仍能维持较高的耗糖速率。

图2 玉米浆添加浓度对L-缬氨酸发酵的影响

由图2-B可看出，随着玉米浆浓度的增加，菌体生物量及发酵液中副产物丙氨酸和乳酸的积累量明显增加。玉米浆添加浓度为45 mL/L时菌体最大生物量高达31.3 g/L，分别较前三者(最大生物量依次为19.8、22.4、28.5 g/L)提高了 36.7%、28.4% 和8.9%。而初始玉米浆浓度分别为15 mL/L和45 mL/L时，积累丙氨酸最大浓度依次为3.1 g/L和6.7 g/L，积累乳酸的最大浓度分别为0.6 g/L和3.1 g/L，这说明随着初始玉米浆浓度升高，虽然能够获得更多的生物量，但是积累的副产物也急剧增加，这可能是因为当玉米浆浓度升高时，发酵液中菌体浓度高，底物消耗增大，同时耗氧量增加，导致供氧不足从而使副产有机酸积累增多。

此外，在一定范围内，L-缬氨酸产量随着玉米浆浓度的增加而增加，在玉米浆浓度为35 mL/L时达到最大产量52.0 g/L，而玉米浆添加浓度为45 mL/L时L-缬氨酸产量反而下降，为51.2 g/L，较前者下降1.5%。可以看出，一方面，随着玉米浆浓度增加，菌体生物量及耗氧量大副增加，当供氧不足时，葡萄糖降解通过三羧酸循环的氧化受到抑制，细胞内丙酮酸水平提高，L-缬氨酸的合成前体增加，因而有利于L-缬氨酸的积累[7］;另一方面，玉米浆浓度过高时，造成乳酸和丙氨酸等代谢副产物大量生成并积累，降低细胞能量利用率，从而降低L-缬氨酸产量。

2.3 玉米浆浓度对耗氨速率及NH4+浓度的影响

在L-缬氨酸发酵过程中需要自动流加氨水来维持pH的稳定，铵盐可以作为发酵过程中的无机氮源和缓冲剂，但NH4+浓度过高，既会抑制菌体生长，易导致副产物乙酸、乳酸等有机酸大量生成，还可对代谢过程产生不利影响[8］。

图3 玉米浆浓度对耗氨速率及浓度的影响

由图3-A可看出，不同玉米浆添加浓度发酵时耗氨速率有较明显差异。在发酵前期，随着玉米浆浓度的增加，菌体的耗氨速率呈现加快趋势。可以看出，当玉米浆浓度为45 mL/L时，在24 h前能够维持最高的耗氨速率，但发酵中后期耗氨速率明显减缓，39 h达到最大速率45.5 mmol/(L·h)后，耗氨速率快速下降。同时，虽然玉米浆浓度为35 mL/L时在发酵前期耗氨速率较前者慢，但发酵中后期约24 h耗氨速率较前者加快，35 h即达到最大耗氨速率47.4 mmol/(L·h)，且后期耗氨速率下降趋势明显较前者减缓，这说明其在发酵后期菌体仍能够维持较高的活力。此外，玉米浆浓度为15 mL/L和25 mL/L时，菌体耗氨速率明显较前两者缓慢，且在整个发酵过程中没有出现明显的耗氨高峰期，仅维持较低的耗氨速率至发酵结束。

2.4 玉米浆与生物素的混合使用

生物素又称维生素H或辅酶R，生物素作为酶的辅助因子以多种方式参与微生物的代谢过程:参与丙酮酸脱羧反应;合成脂肪酸、蛋白质和聚糖等;合成吡啶核酸、核苷酸，形成嘌呤核嘧啶的碱基[11］。在L-缬氨酸发酵生产中，生物素用量直接影响菌体生长、副产物积累及产酸量的高低[12］。生产上可作为生物素来源的原料有玉米浆、豆饼水解液、酵母以及糖蜜等。一般玉米浆中生物素含量相对较少，约180 μg/kg，若单独添加玉米浆容易造成生物素供给不足，不利于菌体生长及L-缬氨酸生产，因此，分别在发酵培养基(有机氮源为35 mL/L玉米浆或豆饼水解液)中添加 0、50、100、150、200 μg/L 的生物素，考察其对菌体生长和L-缬氨酸产量及副产物积累等参数的影响，结果如表1所示。

表1 不同生物素浓度下L-缬氨酸分批发酵过程参数比较

由表1可以看出，随着生物素添加浓度的增加，菌体生物量明显增加，副产物及L-缬氨酸产量均有不同程度增加，发酵周期也有一定程度缩短。生物素添加量为200 μg/L时，可获得最大生物量34.6 g/L，生物量较不添加生物素时提高27.2%，同时发酵液中乳酸及丙氨酸含量也最高，糖酸转化率却最低;而生物素添加量为150 μg/L时可获得最大L-缬氨酸产量50.6 g/L，较不添加生物素时提高25.8%，糖酸转化率也相对较高。此外，与原始发酵工艺采用豆饼水解液相比，生物素添加量相同时，玉米浆作为有机氮源可以使生物量及产酸分别提高3.8%和7.3%。

在生物素充足时，丙酮酸的氧化速率虽然也有提高，但由于糖降解速率显著提高，打破了糖降解速率与丙酮酸氧化速率之间的平衡，丙酮酸趋于生成乳酸的反应，因而会引起乳酸的溢出[13］。因此，发酵过程中需控制合适的生物素含量，防止出现只长菌不产酸的现象，有效降低副产物的积累，这对提高糖酸转化率及降低提取成本具有重要意义。

3 讨论

影响L-缬氨酸产量的因素有很多，如菌株、培养基和培养条件等，控制合适的有机氮源及最佳初始添加浓度，对提高菌体生物量以及L-缬氨酸的产酸水平具有重要意义。Okamto等报道有机氮源中含有菌体生长必需的生长因子和微量元素，用量不当会引起L-苏氨酸产量20%～30%的波动[14］。玉米浆是一种用亚硫酸浸泡玉米而得的浸泡水浓缩物，含有丰富的氨基酸、核酸、维生素、无机盐等，本文通过使用玉米浆替代豆饼水解液作为L-缬氨酸发酵的有机氮源，在降低原料成本的同时，使菌体生物量及产酸分别提高了3.8%和7.3%。

此外，在L-缬氨酸的发酵过程中有丙氨酸及乳酸等杂酸的积累，造成了碳源的浪费。秦永锋等[15］通过在初始发酵培养基中添加2.0 g/L柠檬酸钠，缓解了EMP途径和TCA循环之间存在的“碳源溢流”，从而减少流向副产物(L-丙氨酸和HAc)的代谢流量，使L-缬氨酸生物合成途径的代谢流量提高了10.7%。

L-缬氨酸发酵生产中，生物素用量直接影响菌体生长、副产物积累及产酸量的高低。如果生物素过量，容易造成菌体大量繁殖，易产生副产物乳酸及琥珀酸，从而降低产酸及糖酸转化率。若生物素低则容易导致菌体生长慢，耗糖慢，发酵周期长，易染菌等现象，同样不利于L-缬氨酸发酵的顺利进行。本文考察了玉米浆与生物素不同配比对L-缬氨酸分批发酵过程的影响后，确定了最适生物素添加浓度，较原始发酵工艺(豆饼水解液，表1)相比，最终使菌体生物量及产酸提高了13.2%和18.5%，同时在一定程度上缩短了发酵周期，提高了设备利用率，这对工业化生产降低发酵成本具有重要意义。

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ABSTRACTThe effects of organic nitrogen sources on the fermentation of L-valine were studied with L-valine-producing strain Corynebacterium glutamicum XV0505.Corn steep liquor was selected as the appropriate nitrogen source instead of soybean hydrolysates to reduce the cost of fermentation.The effects of initial concentration of corn steep liquor in fermentation process on biomass，glucose consumption rate，yield of L-valine，accumulation of byproduct and ammonia consumption rate were studied by carrying out fed-batch fermentation.The optimal initial concentration of corn steep liquor was also determined.The effects of the combined agents，biotin and corn steep liquor，on overproduction of L-valine were also studied，and the concentration of biotin was optimized.Compared with those of the original process，the biomass and L-valine production from the improved process were increased by 13.2%and 18.5%respectively.

Key wordsorganic nitrogen，L-valine，corn steep liquor，biotin

The Effects of Organic Nitrogen Sources on the Fermentation of L-valine by Corynebacterium glutamicum

Xu Qing-yang，Sun Jia-kai，Wu Xiao-jiao，Wang Jing，Xie Xi-xian，Chen Ning
(College of Biological Engineering，Tianjin University of Science＆ Technology，Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，Tianjin 300457，China)

助理研究员(陈宁教授为通讯作者)。

*国家科技重大专项(2008ZX09401-05);天津市科技支撑计划重点项目(08ZCKFSH01900)

2011-12-09，改回日期:2012-03-01