肖伊莎，汪 勇，张广文

（暨南大学食品科学与工程系，广东广州510632）

响应面法优化无溶剂体系磷脂酶A1催化酯化制备低聚甘油酯的研究

肖伊莎，汪 勇，张广文

（暨南大学食品科学与工程系，广东广州510632）

以工业油酸和低聚甘油为原料，经磷脂酶A1（Lecitase Ultra）催化酯化制备低聚脂肪酸甘油酯。利用响应面法优化实验条件，研究反应时间、反应温度、加酶量、加水量以及底物摩尔比值（工业油酸和低聚甘油摩尔比值）对其酯化率的影响。得出最佳反应条件为：反应温度45℃，加酶量1.6wt%（占底物总质量），加水量4wt%（占底物总质量），反应时间12h，底物摩尔比值为1∶1。最佳条件下酯化反应平均酯化率可达到56.6%。采用HPLC-ESI质谱通过检测相对分子质量验证了部分低聚甘油酯产物的种类。

聚甘油酯，响应面法，磷脂酶A1，酯化

Abstract：Production of oligomerized polyglycerol fatty acid ester by esterification of industry grade oleic acid with oligomerized polyglycerol catalyzed by phospholipase A1（Lecitase Ultra） was investigated in this study．The reaction parameters including reaction time，reaction temperature，enzyme dosage，molar ratio of substrates（industry grade oleic acid to oligomerized polyglycerol） and water dosage were studied using response surface methodology（RSM）.Optimum conditions obtained by RSM were as follows：reaction temperature 45℃，enzyme dosage 1.6wt%（of the substrates mass） molar ratio of oliomerized plyglycerol to fatty acid 1∶1，reaction time 12h and water dosage 4wt%.Under these conditions，esterification efficiency of the reaction mixture was 56.6%.Some oligomerized polyglycerol fatty acid ester molecular species were identified by HPLC-ESI-MS.

Key words：polyglycerol fatty acid ester；response surface methodology；phospholipase A1（Lecitase Ultra）；esterification

聚甘油脂肪酸酯（polyglycerol fatty acid ester，PGFE）简称聚甘油酯，是由聚甘油与脂肪酸直接酯化或与甲酯、油脂进行酯交换而制得，是一类新型、高效、性能优良多羟基酯类非离子型表面活性剂，其具有乳化、保湿、抗菌等作用[1]。PGFE乳化性能比单甘脂优越，原因在于PGFE有更多的亲水性羟基[2]，且其亲水性、亲油性可以通过改变聚甘油聚合度、脂肪酸种类以及酯化度来实现，从亲油性到亲水性不同性能的一系列聚甘油产品，以适于各种特殊用途[3]。另外PGFE可很好地与其他乳化剂复配，具有良好的协同增效作用，因而至今PGFE的应用也已经逐步扩展到日化、石油、纺织、医药等领域[4-8]。我国PGFE的开发和应用起步较晚，与国外精致PGFE制品差距依然较大，且品种单一，目前我国PGFE产品的这种现状已经不能满足多层次、多行业、多领域的实际需求。现阶段PGFE是聚甘油通过与脂肪酸酯化反应，或通过与动植物油脂进行酯交换反应得到。聚甘油和脂肪酸酯化主要方法有：脂肪酸酯化法、油脂酯交换法和酯酶合成法[9]。其中采用生物催化剂法制取PGFE，可以在较低温度下反应，避免了使用传统化学方法必须在高温或者高压下才能制取PGFE和提纯产品缺陷，也有利于抑制副反应和提高产品质量，具有很好的发展前景。磷脂酶A1（Lecitase Ultra）是由一种基因改造的米曲霉微生物进行深层发酵制得的，我们前期研究发现其具有脂肪酶催化特性，可以催化脂肪酸和多元醇的酯化反应[10]。和脂肪酶相比，磷脂酶A1价格便宜，成本优势明显。本研究采用磷脂酶A1无溶剂体系催化酯化制备低聚甘油酯产品，详细研究反应时间、反应温度、加酶量和加水量以及底物摩尔比对酯化反应的影响，并通过响应面设计实验获得了最佳酯化条件（本研究中所指的低聚甘油原料为二聚和三聚甘油）。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

磷脂酶A1 丹麦诺维信公司，活力3000U/mL；工业油酸 济南东润精化科技有限公司采购；甘油、氢氧化钠 市售化学纯。

SZCL-2数显职能控温磁力搅拌器 巩义予华仪器有限责任公司；HR-120电子天平、PL602-S精密天平 梅特勒-托利多中国地区有限公司；DT5-4低速离心机 北京时代北利离心机有限公司；GC-7820A气相色谱 美国安捷伦公司；DHG-9123A电热恒温鼓风干燥箱 上海恒一科技有限公司；MD-80分子蒸馏设备 广州汉维有限公司；LC-20AT液相色谱日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 反应原料的合成与分析

1.2.1.1 低聚甘油的合成与分析 称取60.0g甘油置于250mL三口烧瓶中，加入氢氧化钠作为催化剂，在260℃的温度和充满氮气保护的条件下反应4h，再通过二级分子蒸馏分别在110、170℃分离纯化得到低聚甘油产品；由气相色谱（GC）分析低聚甘油产品成分。

气相色谱条件：色谱柱ATTM-Wax毛细管柱（15m×0.32mm×0.25μm），色谱条件为：进样口：280℃，分流比：20∶1；检测器：280℃；100℃保持0min，60℃/min升温至165℃保持5min，60℃/min升温至230℃保持3min，10℃/min升温至240℃保持1min，10℃/min升温至250℃保持1min，10℃/min升温至260℃保持2min；载气：高纯氮气，采用氢火焰检测器（FID）。以各聚甘油物质出峰的峰面积为基数，采用归一法计算个组分的相对含量[11]。低聚甘油组成为：甘油5.9%，二聚甘油60.0%，三聚甘油34.1%。

1.2.1.2 原料工业油酸的脂肪酸组成分析 GC分析脂肪酸组成，原料脂肪酸甲酯的制备参照GB/T 17376-2008。

气相色谱条件：HP-5型毛细管柱（30m×0.32mm×0.25μm），进样口：240℃，分流比：80∶1；检测器：240℃；100℃保持0min，60℃/min升温至170℃保持5min，60℃/min升温至230℃保持3min。载气：高纯氮气，采用氢火焰检测器（FID）。以各脂肪酸出峰的峰面积为基数，采用归一法计算个组分的相对含量[11]。

得到原料工业油酸的脂肪酸组成为亚油酸53.0%、亚麻酸5.5%、油酸17.2%和棕榈酸24.3%。

1.2.2 单因素实验 称取工业油酸和一定摩尔比的低聚甘油置于50mL烧瓶中，依次加入一定量的磷脂酶A1和去离子水，通过数显职能控温磁力搅拌器控制温度和搅拌转速（300r/min），在真空（绝对压力5kPa）下反应一定时间，分别考察反应温度（30～70℃）、反应时间（2～14h）、磷脂酶A1添加量（0.4wt%～1.6wt%）、水的添加量（2wt%～12wt%）、反应底物摩尔比值（2∶1～1∶2）对酯化反应的影响。

每次酯化反应结束后，将反应液在3000r/min下离心10min分层，下层为极性相，即未反应完的低聚甘油，上层为油相，即低聚甘油酯和脂肪酸混合物，测定上层油相的酸值，并计算酯化率，酯化率按如下公式计算：

酯化率（%）=（AV0-AVr）/AV0×100

式中：AV0为工业油酸酸值；AVr为反应后油相酸值。

1.2.3 响应面实验 根据单因素实验结果以及因素影响分析，固定加水量为4wt%、反应温度为45℃，进行响应面法优化实验，对影响酯化反应的关键因素反应时间（A）、加酶量（B）、底物摩尔比值（低聚甘油和脂肪酸）（C）进行研究。以反应酯化率（Y）为响应值，得到酯化率和各个影响因素之间的关系回归方程。确定酶催化酯化的最佳条件。用Design expert统计软件设计响应面实验，见表1。

表1 Box-Behnken设计实验因素水平及编码Table 1 Box-Behnken design test factors and levels and coding table

1.3 分析方法

1.3.1 酸值测定 按GB/T 5530-2005滴定法测定。

1.3.2 酯化产物的HPLC和HPLC/ESI/MS分析 将响应面优化实验的酯化产物配成10.0mg/mL的样品。

HPLC条件为：流动相V（乙腈）∶V（异丙醇）∶V（甲酸）=55∶45∶0.05，流速0.5mL/min，柱温40℃，紫外检测波长210nm，色谱柱为Alltima silica C18，No.88171柱（250mm×4.6mm，5μm）；质谱条件为：电喷雾（ESI）离子源，正离子模式，m/z：100～1500，离子扫描速率为5500amu/s。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 加水量对反应的影响 分别加入摩尔比值为1∶1的工业油酸和低聚甘油的底物和1.0wt%（底物重量）的磷脂酶A1，在温度45℃、搅拌速度300r/min的条件下反应6h。考察加水量（wt%）对酶催化酯化反应的影响，结果见图1。

图1 加水量对磷脂酶A1催化酯化反应的影响Fig.1 Effect of water loading on the FFA-glycerol esterification efficiency

从图1可以看出，磷脂酶A1催化酯化反应加水量为4wt%的时候最合适，反应得到产物酸值最低。在酶催化酯化反应中，初始时加入适量的水可以活化酶并且提高酶的催化活性，因为水是保持酶构象并维持活力的因素之一[11]。但是理论上酯化反应是水解反应的逆反应，反应中产生过量的水会促使酯化反应逆向进行。所以我们在抽真空的环境下进行反应，使反应中生成的水被及时抽出，从而保证反应的热力学平衡向需要的正方向进行[12]。

2.1.2 温度对反应的影响 分别加入摩尔比值为1∶1的工业油酸和低聚甘油底物、1wt%磷脂酶A1和4wt%水，在搅拌速度300r/min的真空条件下反应6h，考察温度对酶催化酯化反应的影响，结果见图2。

图2 温度对磷脂酶A1催化酯化反应的影响Fig.2 Effect of reaction temperature on the FFA-glycerol esterification efficiency

从图2可以看出，磷脂酶A1催化酯化反应温度为45℃的时候最合适，反应得到产物酸值最低为120.4mg KOH/g，即酯化率为最高43.2%，这与它催化部分酯化反应的最适温度相同[13]。酶的活力与反应温度的高低有直接的关系，温度高，分子运动快，酶解速度快，但是当温度过高时，它会影响酶蛋白的活力，使酶失去活性。

2.1.3 加酶量对反应的影响 分别加入摩尔比值为1∶1的工业油酸和低聚甘油的底物和4wt%水，在温度45℃、搅拌速度300r/min的真空条件下反应6h。考察加酶量（wt%）对酶催化酯化反应的影响，结果见图3。

图3 加酶量对磷脂酶A1催化酯化反应的影响Fig.3 Effect of catalyst loading on the FFA-glycerol esterification efficiency

酯化反应速度的快慢直接和酶的浓度相关。酶浓度高，参与反应的酶的分子就多，相应的酯化速度就快[14]。从图3可以看出，随着加酶量的增加，产物酸值不断降低并且在加酶量为1.6wt%时达到最低值，此时酯化率为最高48%。但是当加酶量超过1.4wt%时，这种增长趋势减缓，这是因为这时当酶与底物混合后的反应接触面积趋于饱和，酶的增量对反应影响变小。

另外，酶是酯化反应中成本最高的原料，所以在保证酯化率的前提下较低的加酶量是反应工业化的前提条件。所以在实验范围内，当加酶量增加酸值不断降低，但是从经济角度讲，加酶量1.4wt%为最佳反应条件，因为继续提高加酶量并没有明显降低酸值。

2.1.4 底物的摩尔比值对反应的影响 分别加入不同摩尔比值的工业油酸和低聚甘油的底物、4wt%水和1.4wt%磷脂酶A1，在温度45℃、搅拌速度300r/min的真空条件下反应6h。考察底物的摩尔比值对酶催化酯化反应的影响，结果见图4。

图4 底物的摩尔比值对磷脂酶A1催化酯化反应的影响Fig.4 Effect of mole ratio of industrial oleic acid to polyglycerol on the esterification efficiency

低聚甘油和脂肪酸的底物摩尔比对酯化反应具有决定性的影响。从图4可以看出，随着低聚甘油和脂肪酸摩尔比增加，反应越彻底，并在低聚甘油与脂肪酸比值为1∶1时反应酯化率达到最高值为40.0%。然而，当底物摩尔比继续提高，反应产物酸值反而升高，这是因为过多的低聚甘油增加了反应系统的粘度，同时增大了除去反应过程生成的水的难度，过量的水抑制反应物的移动和反应速率[15]。

2.1.5 时间对反应的影响 分别加入摩尔比值为1∶1的工业油酸和低聚甘油的底物，1.4wt%磷脂酶A1和4wt%水，在搅拌速度300r/min的真空条件下反应，考察温度对酶催化酯化反应的影响，结果见图5。

图5 时间对磷脂酶A1催化酯化反应的影响Fig.5 Effect of reaction time on the esterification efficiency

从图5可以看出，磷脂酶A1催化酯化反应随着时间的延长，产物的酸值不断降低。当反应12h后，产物酸值达到110左右，酯化率达到较高值47.6%。12h以后虽然反应时间延长，但产物酸值基本趋于稳定，反应整体达到了动态平衡。

2.2 响应面实验

磷脂酶A1催化低聚甘油和油酸酯化响应面结果分别见表2。

表2 酯化反应的响应面设计及结果Table 2 Box-Behnken design test results

采用Design Expert软件，对表2中反应酯化率实验数据进行回归拟合，得到反应酯化率对编码自变量的二次多项回归方程：

Y=49.22+2.79A+13.19B-6.3C-0.95AB-0.18AC+2.12BC-5.16A2-6.41B2-9.34C2

回归模型方差分析见表3。由表3可知，回归模型F值为21.89，p＜0.01，表明回归模型极显著；失拟项p=0.0838＞0.05，表明失拟项相对于绝对误差是不显著的，因此回归模型无失拟因素存在；相关系数R2=0.9657，说明方程拟合情况较好，模型能解释96.57%的反应产物酸值响应值的变化；由模型系数显著性检验结果可知，加酶量和底物摩尔比值是极显著因素，各因素对转化率的影响顺序为：B＞C＞A。

运用Design Expert软件的回归模型进行显著因素水平的优化分析，求得最佳反应条件为：加酶量1.59wt%，底物摩尔比值0.91∶1，反应时间11.36h。预测酯化率最高为56.7%。考虑到实际操作的便利，确定酯化反应最佳条件为：加酶量1.6wt%，底物摩尔比值1∶1，反应时间12h。在上述条件下进行2次平行验证实验，得到酯化率分别为56.1%、57.0%，平均值为56.6%。实验值与模拟计算值有较好的拟合性。酯化率没有超过60%的原因是反应体系为无溶剂体非均相系，聚甘油粘度很大，反应体系传质较困难，需要采用其他新型反应体系加强传质。

表3 回归模型方差分析Table 3 ANOVA for the fitted quadratic polynomial model

2.3 酯化产物的HPLC和HPLC/ESI/MS分析鉴别

反相液相色谱法（HPLC-RP）分析中甘油酯的保留时间会随着等效碳数（equivalent carbon number ECN）的增加而增加，ECN是由总碳数（CN）减去两倍双键（DB）所得，即ECN=CN-2DB，所以具有相同ECN的不同种类PGEF会被同时洗脱出来；采用HPLC分析时，样品可以不需要进行衍生化处理，能直接将聚甘油酯组分按照类型分离，Brnmo Marcato等[16]采用HPLC分析聚甘油酯，获得了较好的分离效果。

将按照最佳反应条件得到的酯化反应产物分别进行HPLC分离和HPLC/ESI/MS分析，得到低聚甘油酯的质谱图谱见图6。

图6 低聚甘油酯产物的HPLC-ESI-MS的正离子峰图谱Fig.6 electropositive ionic peak HPLC-ESI-MS of the lowly polyglycero production

用HPLC/ESI/MS可以进一步分析鉴别产品中各种低聚甘油酯的成分。电喷雾离子化（ESI）技术只用于多电荷状态下也稳定存在的大分子物质，加上几乎没有反常峰，非常适合测定物质分子量[16]，其中物质的正离子峰通常会由Na或者K结合正离子得到，如图6所示。由图6可知，低聚甘油酯产物的HPLCESI-MS的正离子峰图谱，图谱中的低聚甘油酯产品中不同的二聚甘油酯和三聚甘油酯产物分别和钠或钾结合为分子离子，由图6可看出部分产物的种类，如亚麻酸的三聚甘油单酯、油酸亚油酸的二聚甘油二酯以及亚油酸二聚甘油三酯等。由此可知，酶法催化低聚甘油酯化，由于空间阻力，低聚甘油的羟基并没有完全酯化，而是部分酯化。

3 结论

3.1 磷脂酶A1可以催化酯化工业油酸和低聚甘油，优化方法后的产物，分别通过HPLC分离和HPLC/ESI/MS方法，分析确定了其中含的低聚甘油酯，其中催化酯化反应中酯化率受加酶量影响最大。

3.2 以酯化反应产物酸值为指标，采用三因素三水平的中心组合设计，对工业油酸和低聚甘油为原料制备低聚甘油酯的实验条件进行优化，通过Design Expert软件对实验结果进行分析，确定最佳反应条件为：反应温度45℃，加酶量1.6wt%，底物摩尔比值1∶1，反应时间12h，加水量为4wt%。最佳条件下酯化反应平均酯化率为为56.6%。

3.3 采用HPLC-ESI质谱通过检测相对分子质量验证了部分低聚甘油酯产物的种类，磷脂酶A1催化得到的聚甘油酯并未完全酯化，为部分酯化聚甘油酯。

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Optimization of preparation of polyglycerol fatty acid ester catalyzed by Phospholipase A1 in a solvent free system using response surface methodology

XIAO Yi-sha，WANG Yong，ZHANG Guang-wen
（Department of Food Science and Engineering，Jinan University，Guangzhou 510632，China）

Q559

A

1002-0306（2012）20-0191-05

2012-04-05

肖伊莎（1988-），女，在读硕士研究生，研究方向：食品科学。

粤港关键领域重点突破项目（2009A020700003）。