赵 雷

（长春中医药大学教务处，吉林 长春 130117）

姜黄素诱导雄性激素依赖性前列腺癌LNCaP多耐药细胞凋亡

赵 雷

（长春中医药大学教务处，吉林 长春 130117）

前列腺癌细胞的多耐药性（multidrug-resistance，MDR）常常导致临床上前列腺肿瘤化疗的失败。研究耐药机制，寻找分子靶点，研发高效、低毒的MDR抑制剂是目前面临的挑战。研究表明，化疗药物诱导凋亡耐受在前列腺肿瘤细胞MDR形成过程中起着十分重要的作用。因此，寻找前列腺癌多耐药抑制剂，促进细胞凋亡可以在很大程度上降低前列腺癌MDR。

姜黄素（Curcumin，Cur）是一种从姜黄根茎中提取得到的黄色色素［1］。姜黄素有重要和广泛的药理作用，如降血脂、抗氧化、抗发炎［2］、抗动脉粥样硬化等［3］。2004年时发现姜黄素能抑制HIV-1整合酶活性而用于艾滋病的临床试验。此外，抗癌是姜黄素的主要药理活性之一，其抑制肿瘤的作用已在许多动物实验中得到反复证实，其具体抗癌机制已成为近期研究热点［4，5］。

NF-κB（nuclear factor-κB）是一种分布和作用均十分广泛的真核细胞转录因子，通过多条信号通路与肿瘤细胞的多耐药性相关［6］。王漪等2007年研究发现，白血病细胞中NF-κB调控 MDR1基因，参与耐药逆转［7］。研究表明，NF-κB、Bcl-2、p53和c-jun等分子与前列腺肿瘤细胞的发生和发展关系密切［8，9］。

本研究的目的在于研究姜黄素与NF-κB信号通路的联系，及其诱导雄性激素依赖性前列腺癌LNCaP多耐药细胞凋亡的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株雄性激素依赖性前列腺癌细胞系LNCaP购自上海细胞库，用DMEM培养基（含15%牛血清）在CO2培养箱中培养，消化传代用0.25%胰蛋白酶液。多耐药细胞的制备参考文献［10］。

1.2 试剂姜黄素购自Sigma公司；总蛋白提取、总RNA提取试剂盒购自Promega。鼠源单克隆抗体：NF-κB抗体、磷酸化c－jun抗体、P-gp（P-glycoprotein）抗体、p53抗体、bcl-2抗体、GAPDH抗体购自ABCam。HRP标记羊抗鼠二抗购自abcam。甲唑蓝（MTT）购自Sigma；M-MLV逆转录试剂盒购自 Promega；2×SYBR real-time PCR试剂盒购自Roche公司；BCA蛋白定量试剂盒，ECL发光检测试剂盒购自Pierce。

1.3 姜黄素培养细胞细胞以1×106／ml的浓度接种到6孔板，孔内放2ml DMEM（10%小牛血清），培养24h。换新鲜培养液，其中含有溶解的不同浓度姜黄素。继续培养48h，分别用real-time PCR和 western blot检测 NF－κB、Bcl-2、p53、磷酸化c－jun，用MTT检测细胞增殖。抑制肿瘤的生长率＝（无药对照孔OD值－用药孔OD值）／无药对照孔OD值×100%。未添加姜黄素的细胞作为对照。

1.4 QPCR收集细胞，用试剂盒提取总RNA，MMLV第一链cDNA合成试剂盒说明书合成cDNA，以cDNA为模板按照试剂盒操作说明进行real-time PCR，每个反应体系中均加入GAPDH的一对引物作为PCR扩增的内参，反应条件：95℃30s-56℃60s-72℃60s，35个循环。用 Beacon designer 7根据Genbank序列设计引物，经过Blast验证，上海生工引物合成和基因测序。引物序列如表1。

表1 引物序列

1.5 Western blot检测收集PC-3M／CDDP细胞，按照试剂盒说明，用真核细胞裂解液裂解，提取总蛋白，BCA法进行蛋白定量。用12%SDS-PAGE凝胶进行电泳，凝胶通过湿转装置将蛋白转移至NC膜后，将膜置于封闭液（含10% 脱脂奶粉的PBST）中，于摇床摇匀1h。用TBST清洗三次，每次5min，弃清洗液。稀释一抗（1∶1000）于封闭液中。将膜置于一抗液中，室温摇床1h。用TBST清洗三次，每次5 min，弃去清洗液。稀释 HRP标记二抗（1：500）于封闭液。将膜置于上述液中室温摇床1h。用TBST清洗3次，每次5 min，弃去清洗液。ECL试剂盒显色，X胶片定影。采用GAPDH蛋白内参。

1.6 统计学数据处理数据用±S表示，采用SPSS12.0统计分析软件进行分析。组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有显著性。

2 结果

未姜黄素处理细胞的 NF－κB、磷酸化c－jun和bcl-2蛋白质水平比较高，p53蛋白水平低，说明细胞凋亡水平低，而NF-κB信号通路、JNK信号通路活性高。P-gp是mdr1基因表达的蛋白质，其水平高，说明存在较高的细胞多耐药。姜黄素作用后，NF-κB、磷酸c-jun、bcl-2蛋白水平显著下降，说明NF－κB、JNK信号通路明显受到抑制。此外，p53蛋白水平显著升高，说明细胞凋亡增加。P-gp水平显著降低，则细胞多耐药性显著减小。相应的灰度值见表2。

表2 各分子相对GAPDH的blot灰度值（48h，%）

LNCaP细胞48h生长率约为92%。不同浓度姜黄素作用后，细胞48h生长率显著下降，分别是变成30%、17%、3%。

3 讨论

肿瘤MDR能够抵抗临床药物的抗肿瘤作用，并且阻抑MDR肿瘤凋亡。本研究中，姜黄素作用于雄性激素依赖性前列腺癌 MDR细胞以后，NF-κB信号通路降低，mdr1／P-gp表达水平下降，bcl-2表达减少，c-Jun磷酸化减弱，而p53表达水平却显著升高，MDR细胞的凋亡显著升高、MDR则显著下降。相应的，细胞生长也受到显著抑制。

前列腺癌细胞耐凋亡与NF-κB信号通路相关联。本研究中，雄性激素依赖性前列腺癌MDR细胞经过姜黄素的作用，NF-κB信号通路受到显著抑制，级联反应导致磷酸c－jun水平显著下降，抑制JNK信号通路。NF-κB信号减低也造成了mdr1／P-gp表达的显著降低［7］，肿瘤 MDR逆转成为药物敏感。

细胞凋亡过程复杂，包括多个基因的调控［11］。前列腺癌细胞表达p53、bcl-2和c-jun，其中p53上调指示细胞凋亡启动，并且p53对于NF－κB存在相反关联的效应。NF-κB信号可以通过上调下游bcl-2表达、增强c-jun信号磷酸化激活JNK信号通路，抑制化疗药物诱导型细胞凋亡，最终细胞出现耐药。在本研究中，姜黄素作用，减低了NF－κB信号，并导致下游bcl-2显著下调，以及c－jun磷酸化水平减弱。作为相反关联的凋亡蛋白p53表达则显著增强，MDR前列腺癌细胞的抗凋亡作用显著减弱并启动凋亡进程，然后，细胞生长受到显著抑制。

总之，本研究结果表明，前列腺癌细胞MDR可能与NF－κB信号介导的抗凋亡作用有关，因此，NF-κB信号可能作为前列腺癌治疗的分子靶点。并且，姜黄素作用于MDR前列腺癌细胞，抑制NF－κB信号，下调bcl-2和磷酸化c－jun水平，抑制抗凋亡基因，减小癌细胞MDR，因此，姜黄素有可能治疗MDR前列腺癌。

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1007－4287（2012）10－1920－02

2011－08－17）