杨 敏，甘伯中 ，张卫兵，梁 琪，乔海军

(1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州 730070;2.甘肃农业大学理学院，甘肃兰州 730070)

酪蛋白胶束酶法修饰研究进展

杨 敏1，2，甘伯中1，*，张卫兵1，梁 琪1，乔海军2

(1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州 730070;2.甘肃农业大学理学院，甘肃兰州 730070)

酪蛋白的稳定性与其结构密不可分。酶法修饰作为一种安全性较高的修饰技术，受到众多研究者的关注。本文综述了近年来国内外关于酪蛋白酶法修饰研究进展，讨论了修饰酪蛋白的稳定性及功能性质，以期为乳制品加工提供参考。

酪蛋白胶束，酶法修饰，酶促交联，水解

酪蛋白是乳中一大类蛋白质的总称，又称干酪素，乳中酪蛋白含量约为总蛋白的80%，主要由αs1、αs2、κ 和 β－酪蛋白组成，其质量比约为 4∶1∶4∶1［1］。κ－酪蛋白是酪蛋白中唯一含有糖成分的、对钙不敏感的蛋白质。牛乳中这四种酪蛋白单体与磷酸钙相互结合成直径为 100～300nm 的胶束［2－3］。酪蛋白和酪蛋白制品有着较高的营养价值和良好的功能特性。在食品工业中，酪蛋白及其制品被广泛用作营养补充剂。在饮料工业中，酪蛋白可以作为酸性饮料的稳定剂、酒和啤酒的澄清剂、苹果汁的脱色剂。此外，酪蛋白及其制品还广泛应用于肉制品、烘焙食品、人造奶油、咖啡伴侣中。在化学工业中，酪蛋白溶于碱可以得到黏性强的胶状液。酪蛋白纤维表现出良好的吸湿性、亲水性和拉丝性，适合作内衣、运动衫、儿童服装、睡衣、床上用品等与皮肤直接接触的织物。影响蛋白质功能特性的主要因素有:蛋白质自身，包括蛋白质的氨基酸组成、分子大小、构象等;蛋白质所处体系的性质，包括温度、酸度等;蛋白质分子内和分子间的相互作用。随着对蛋白质的深入研究，蛋白质修饰也作为一种有用的工具来调控蛋白质结构，提高其营养价值、感官特性和功能特性，以满足加工业的要求。酪蛋白可以通过酰化、磷酸化、糖基化和酶法等方法对其进行结构修饰，以改变其理化性质和功能特性，从而满足不同工业生产部门的需要。酶法修饰因其产物具有较高的安全性而成为国内外众多学者的研究热点。

1 酪蛋白酶促交联修饰条件研究

蛋白质在某些酶的催化作用下，氨基酸残基之间可以发生交联反应，或者由于其他物质的存在，最终导致残基之间的交联反应。酶法修饰作用显著，反应条件温和，安全性高，修饰后的酪蛋白稳定性显著增强，粘度、乳化性、溶解性、发泡性、成膜性等功能性质得以提高。

1.1 转谷氨酰胺酶

转谷氨酰胺酶(transglutaminase，TG)，全称为蛋白质－谷氨酰胺－γ－谷氨酰胺基转移酶，它可以催化蛋白质赖氨酸上的ε－氨基和谷氨酸上的γ－酰胺基结合，从而导致蛋白质分子发生共价交联，形成相应的聚合物，改善蛋白质的溶解性、水合性等功能性质。该酶反应条件温和，专一性强，价格低廉，是食品蛋白质修饰首选酶制剂。

转谷氨酰胺酶在温度为40℃，pH7.0条件下活性最高［4］。然而，Schorsch［5－6］研究表明，50℃、pH5.4 的条件下，酪蛋白胶束表面的净电荷降低，斥力最小，为转谷氨酰胺酶交联酪蛋白形成凝胶的最佳条件。为了解决这一矛盾，该学者指出，先将转谷氨酰胺酶加入到50℃酪蛋白溶液中平衡1h，再加入葡萄糖酸－δ－内酯缓慢酸化，直至凝胶形成。Smiddy［7］研究发现，转谷氨酰胺酶在30℃下与酪蛋白反应24h后，β－或κ－酪蛋白单体已不存在，只有少量αS1－酪蛋白，说明酪蛋白胶束内交联反应已接近完全。Jos’e［8］用绵羊乳酪蛋白替代牛乳酪蛋白进行酶法交联研究，结果表明，绵羊乳酪蛋白在进行转谷氨酰胺酶交联之前，于78℃热处理1h，交联程度最高。

酶法交联过程中，除了温度、酸度等因素外，反应体系中添加其他成分对交联反应也产生影响。Martin［9］研究发现，0.05～0.1mmol/L 谷胱甘肽可提高酪蛋白的交联程度。研究还指出，乳清中含有转谷氨酰胺酶的天然抑制剂。将转谷氨酰胺酶与乳清混合而不添加酪蛋白时，酶的活性受到抑制;向该体系中加入谷胱甘肽后，酶活性得以维持。由此可见，加入谷胱甘肽或对乳样进行预先热处理可使乳中酶抑制剂活性降低或丧失，提高交联程度。

国内，酪蛋白的酶法修饰也成为研究热点。姜淑娟等［10－12］研究了酪蛋白的转谷氨酰胺酶氨基葡萄糖修饰与功能性变化，结果表明，酪蛋白浓度3%(w/v)，37℃，pH7.5，酶添加量 10kU·kg－1，氨基葡萄糖浓度90mmol·L－1，反应4h时，交联程度最高。由此可见，转谷氨酰胺酶催化酪蛋白进行共价交联修饰反应条件温和，交联程度高，对酪蛋白结构修饰作用显著。

1.2 其他酶类

除了转谷氨酰胺酶之外，其他交联用酶制剂也受到研究者的关注。李君文、赵新淮等［13］研究指出，辣根过氧化物酶对酪蛋白进行酶促交联的适宜条件为温度37℃，反应时间2.9h、酶添加量为每克蛋白质4.73μkat，此条件下酪蛋白交联度达到6.9%。交联酪蛋白酸化凝胶的微观结构中空穴较未交联酪蛋白少，结构更为致密［14］。

双孢蘑菇多酚氧化酶(PPO)对酪蛋白也具有交联作用。当PPO酶比活力为400U/mL，25℃反应4h时，交联后的酪蛋白乳化性和乳化稳定性分别较未交联的酪蛋白提高了17.3%和37.5%。这些性质的改善程度与形成的聚合物含量有着密切的关系［15］。

2 β－酪蛋白单体的酶促交联

由于β－酪蛋白具有显著的偶极序列，其二级结构易随温度改变，可自聚成胶束。因此，转谷氨酰胺酶对β－酪蛋白的交联作用不仅影响β－酪蛋白单体性质，还能使其在酪蛋白胶束中被“冻结”，稳定胶束结构，从而促进胶束内部酪蛋白单体间发生交联［16］。众多研究指出，β－酪蛋白较α－酪蛋白更易发生共价交联，并且不同温度交联产物具有差异［7，17］。在35℃时，β－酪蛋白发生分子间交联，0℃时发生分子内交联。由于交联修饰改变了β－酪蛋白电荷，使其物化性质发生变化，如亲水性和钙离子稳定性增加，粘度增大，其增大程度与温度无关［18］。Monogioudi［19］比较了木霉菌酪氨酸酶和轮枝链霉菌转谷氨酰胺酶对β－酪蛋白的交联作用，发现两种酶交联产物分子量大小与酶用量和反应时间有关。酪氨酸酶交联产物色泽有轻微变化，其交联程度可通过交联时间控制，交联程度最高可达21，而转谷氨酰胺酶交联度可达71。交联后β－酪蛋白的胃蛋白酶水解性降低，在酸性条件下的稳定性增强［20］。

3 酶促交联修饰对酪蛋白稳定性的影响

酶促交联使酪蛋白内部及酪蛋白之间发生共价连接，形成网状结构，增加了维持酪蛋白结构稳定性的作用力，显著增强了其稳定性。转谷氨酰胺酶对酪蛋白的共价交联发生在胶束内部，稳定了胶束，维持了酪蛋白胶束在加工过程中的完整性，限制了胶体磷酸钙的解离和β－酪蛋白的溶解，凝胶形成时间缩短，凝胶强度、弹性模量增大，凝胶质地密集，长时间贮藏过程中不出现脱水收缩作用，可改善干酪、酸奶的加工特性［21－24］。有研究指出，交联酪蛋白热稳定性和高压稳定性均显著增强［25－26］。

酪蛋白稳定性取决于胶束粒径，粒径越小稳定性越高［22，25－26］。Smiddy［7］研究酪蛋白转谷氨酰胺酶交联条件的同时，还讨论了交联后酪蛋白的稳定性。他指出，当酪蛋白胶束内部疏水性作用完全破坏，或者胶体磷酸钙完全解离时，酪蛋白胶束的光散射量降低95%以上，而转谷氨酰胺酶交联使得酪蛋白胶束稳定性增强，在其他试剂作用下的解离度降低。交联处理24h后，加入尿素、乙醇、十二烷基磺酸钠等试剂后，酪蛋白胶束的光散射现象仍然显著存在，说明交联后的酪蛋白稳定性得到显著改善。Huppertz［27］研究表明，相比未处理酪蛋白，转谷氨酰胺酶酶促交联酪蛋白使位于胶束表面的κ－酪蛋白发生交联，在乙醇作用下难以瓦解，因此交联胶束对乙醇表现出较高稳定性。这一研究结果也被Partschefeld［28］所证实。他指出，转谷氨酰胺酶交联的UHT－酪蛋白胶束对乙醇(0～74vol%)、EDTA(0～0.45mmol/L)和400MPa压力处理表现出较高稳定性。Yin［29］研究发现，转谷酰胺酶交联的酪蛋白与多糖水制备的凝胶稳定性显著提高。

由于交联修饰改变了酪蛋白结构，其功能性质也发生变化。姜淑娟，赵新淮等［10－12］研究指出，与未处理酪蛋白相比，转谷氨酰胺酶氨基葡萄糖修饰酪蛋白的溶解性、乳化性、发泡性、粘度和粘弹性增强，表面疏水性降低，凝胶性质得到显著改善，并且体外消化性能未受到影响。李君文、赵新淮等［14］研究指出，辣根过氧化物酶对酪蛋白进行酶促交联后，酪蛋白乳化性和凝胶结构显著改善。当酪蛋白质量分数为0.04%时交联产物的乳化活性指数、乳化稳定性达到最高，分别比酪蛋白提高25.2%和7.2%。

综上所述，转谷氨酰胺酶对酪蛋白结构修饰作用显著，反应条件温和。修饰后的酪蛋白稳定性显著增强，粘度、乳化性、溶解性、发泡性、成膜性等功能性质得以提高。由于酶法修饰不产生有害物质，安全性高，可广泛用于乳品体系酪蛋白改性，以提高乳制品物化及感官性质，增加产品附加值。

4 酪蛋白酶法水解研究

在许多食品的加工过程中，蛋白质的水解反应是不可或缺的处理或反应。一些食品的加工工艺、产品质地改善、风味物质的形成、营养价值的提高等，均与其中的蛋白质水解直接相关。因此，酪蛋白的限制性水解备受关注。Aline［30］研究酸性土豆磷酸酯酶对酪蛋白的脱磷酸化作用时指出，该酶对α－酪蛋白和β－酪蛋白具有脱磷酸化和水解双重作用，但对酪蛋白胶束仅表现出脱磷酸化作用。该学者采用RP－HPLC－ESI/MS鉴定了脱磷酸化后的酪蛋白，发现该酶最多可随机除去α－酪蛋白上的8个磷酸化基团、β－酪蛋白上的5个磷酸化基团。李丹［31］利用谷氨酰胺酶对酪蛋白进行限制性脱酰胺和水解处理，以SDS－PAGE及排阻色谱分析评价产物的蛋白质降解情况。结果表明，脱酰胺酪蛋白产物对Fe2+和Ca2+的螯合能力高于酪蛋白，并随着脱酰胺度的增加而提高。张志［32］研究指出，酪蛋白酶解产物对Zn2+的络合能力较强，络合产物的稳定性高，体外消化率可达100%。

酪蛋白除了具有基本的营养功能外，在其结构中还含有重要的肽类编码，一旦通过水解技术将这些肽分子释放出来，可以得到特定功能的生物活性肽。吴丹［33］利用木瓜蛋白酶水解酪蛋白，并对所得到的水解物进行类蛋白反应修饰，制备高活性抗氧化肽。酶添加量为500U/g，温度30℃，底物质量分数50%，反应5.6h，类蛋白反应效果较好。有关酪蛋白酶解产物抗氧化活性分析结果表明，所制备的修饰产物对DPPH、·OH、ABTS·3种自由基的清除能力显著提高［34－37］。徐微［38］采用中性蛋白酶水解酪蛋白，一定条件下制备水解度为13.0%，IC50质量浓度为40.4mg/L的酪蛋白水解物。利用中性蛋白酶对所制备出的水解物进行plastein反应修饰。不同反应程度的修饰产物对血管紧张素I转换酶(ACE)抑制活性分析结果显示，中性蛋白酶催化的plastein反应修饰提高酪蛋白水解物的ACE抑制活性且ACE抑制活性的提高程度与plastein反应程度有关。由此可见，酶法水解既能获得具有生物活性的肽，又可提高食品蛋白质的功能性质，具有潜在的应用价值。

5 展望

工业的发展需要稳定性高、功能性质突出的蛋白质配料。乳制品是一个复杂的体系，其中，蛋白沉淀是影响乳制品稳定性的重要因素之一。因此，提高酪蛋白稳定性变得十分重要。酶法修饰可改变酪蛋白胶束结构，显著提高酪蛋白稳定性。酶催化反应条件温和，修饰产物安全性高，具有潜在的实际应用价值。但是，酶制剂价格昂贵，修饰成本高，难以实现工业化。针对该问题，有必要通过物理修饰技术辅助等方法，减少酶制剂用量，提高酶法修饰程度，以期降低修饰成本。

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A review on enzymatic modification of casein micelle

YANG Min1，2，GAN Bo－zhong1，*，ZHANG Wei－bing1，LIANG Qi1，QIAO Hai－jun2
(1.College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China;2.College of Science，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China)

The structure of casein micelle affects its stability.Enzymatic modification is a high security technology of protein structural modification which was studied extensively.This paper reviewed the recent researches on enzymatic modification of casein micelle.It also discussed the stability and functional properties of modified casein with the purpose of providing reference for dairy products.

casein micelle;enzymatic modification;enzymatic cross－linking;hydrolysis

TS252.1

A

1002－0306(2012)17－0413－04

2012－02－13 *通讯联系人

杨敏(1981－)，女，在读博士，讲师，研究方向:乳品科学与技术。

国家自然科学基金资助项目(30960260);甘肃省自然科学研究基金计划重点项目(1107RJZA227)。