宋福强 王 健 孔祥仕 常 伟 王倡宪

(黑龙江大学，哈尔滨，150080)

紫穗槐(Amorpha fruticosa)又称穗花槐，豆科紫穗槐属，多年生落叶丛生小灌木，东北齐齐哈尔以南栽培［1］。紫穗槐被誉为是保持水土流失、防风固沙的“活钢筋”，同时也是解决农牧业肥料、饲料、乡村开展多种经营、增加收入、改良土壤的优良树种。

丛枝菌根(arbuscular mycorrhizal fungi，AM)真菌是一种专性内共生真菌，可以和自然界中绝大多数植物形成互惠共生联合体［2］，提高植株对环境生物和非生物胁迫的耐受力［3］，促进植物对养分的吸收。AM真菌还可以产生生理活性物质，调节植物生理代谢活动，对植物的成活、生长都起到促进作用。而紫穗槐根系发达，侧根丰富，并且能与AM真菌形成很好的共生关系［4-6］，因此可作为AM真菌与木本宿主植物之间互惠共生关系的研究材料。

基因在表达过程中由于mRNA的选择性拼接和修饰即转录后修饰，以及在翻译成蛋白质的过程中经历乙酰化、烷基化、糖基化等翻译后修饰，转录水平所获得的基因表达信息并不足以阐明基因的功能。而蛋白质是生物体的基本功能单位，也是基因功能的最终执行者，因此，从翻译水平上研究基因的表达与功能，是生命科学发展的必然趋势［7］。近年来，蛋白组学在后基因组时代快速发展起来，成为一个分析生物体或者组织内蛋白丰度和蛋白分布的有效工具，用来分析和鉴定不同组织蛋白表达特性以及进行目标蛋白的定位［8］。另一方面，蛋白质组学方法已经被用来研究被AM真菌侵染植物在盐胁迫下蛋白质组变化以及AM真菌—宿主植物共生体系相关蛋白［9-10］。

为了研究紫穗槐菌根形成过程中蛋白质的变化，从蛋白质组水平初步揭示紫穗槐菌根共生体形成的分子机制，提取紫穗槐菌根总蛋白并建立2-DE体系至关重要［11］。但目前，有关紫穗槐菌根蛋白质组学方面的研究尚未见报道。虽然国内有很多学者已建立了其他植物根蛋白质组学的2-DE分离体系［12-14］，但由于不同植物在细胞结构、根蛋白含量以及色素、酚类、醌类、多糖等的含量和种类均存在差异［15］，目前还没有一套体系能够适用于所有植物。因此，根据紫穗槐根组织的特点，建立一套紫穗槐2-DE蛋白分离体系，是进行紫穗槐根蛋白质组学研究的前提。

蛋白质的提取有多种方法，目前常用于植物蛋白组学研究的根蛋白提取方法是TCA丙酮法及酚提取法［16-17］。本研究对比TCA丙酮法及酚提取法，优化出适于紫穗槐菌根蛋白的提取方法。然后对2-DE体系的菌根蛋白上样量以及染色方法进行摸索，建立了一套适用于紫穗槐菌根蛋白的双向电泳体系。以期为揭示紫穗槐菌根形成过程中特异蛋白的表达模式以及后续相关基因功能的研究奠定基础。

1 材料与方法

供试AM真菌接种体为摩西球囊霉(Glomus mosseae，GM)，孢子含量约为1 630个/20 g，由黑龙江大学生态实验室保藏;供试植株紫穗槐种子由吉林省林业科学研究院提供。

1.1 实验设计

将紫穗槐种子先用温水清洗表面，再用0.3%的高锰酸钾浸泡3～4 h进行表面消毒处理，清水洗净。将处理后的紫穗槐种子放入白瓷盘中，表面覆盖湿润白纱布，38℃下催芽，催芽期间适当补水保持种子湿润。与此同时将V(草炭土)∶V(细沙)∶V(蛭石)=5∶2∶3混合配置栽培基质，用牛皮纸包起，121℃、0.1 MPa高压蒸汽灭菌 2 h，取出自然晾干。将催芽后的紫穗槐种子种植在处理后的土壤中，并对其做以下处理：(1)非接种植株(CK)，即在灭菌后的基质中按每千克加入1 g灭活摩西球囊霉接种体，混合均匀;(2)接种植株(GM)，即在灭菌后的基质中按每千克加入1 g摩西球囊霉接种体，混合均匀。接种体由AM真菌的孢子、菌丝、菌根根段组成的根际混合物。

试验在温室盆栽条件下进行，每个处理重复15盆，随机排列。日间温度为25～30℃，夜间为18～20℃，相对湿度为60%～80%，光照16 h/d。每星期浇3次水。第15天开始取样。用Phillip和Hayman的酸性品红染色方法［18］检测菌根侵染情况，取侵染率达90%的根样进行如下试验。

1.2 紫穗槐菌根蛋白提取

TCA法：将3 g根样品用液氮研磨成粉末后，加入10 mL10%的TCA丙酮溶液和7μLβ-巯基乙醇，-20℃静置45 min。20 000 g、4℃离心15 min，去上清留沉淀。向沉淀中加入10 mL丙酮和7μLβ-巯基乙醇，静置1 h。20 000 g，4℃离心15 min，去上清留沉淀。沉淀用10 mL丙酮和7μLβ-巯基乙醇清洗至上清无色。将沉淀真空干燥，所得干粉-80℃保存备用。

酚提取法：将3 g根样品用液氮研磨成粉末后，加入 10 mL 蛋白提取液(0.02 mol/L Tris、0.25 mol/L 蔗糖、0.01 mol/L EDTA、0.01 mol/L PMSF、0.01 mol/L DTT、1%TritionX-100)，研磨 15 min。再加入等体积Tris-饱和酚，继续研磨5 min。然后20 000 g、4℃离心15 min，收集酚相于新的离心管中，向新管加入5倍体积0.1 mol/L的乙酸铵甲醇溶液，-20℃过夜。20 000 g、4℃离心15 min，去上清。最后用含0.07% β-巯基乙醇的丙酮洗涤至上清无色。将沉淀真空干燥，所得干粉置-80℃保存备用。

1.3 紫穗槐根总蛋白定量

使用GE公司的2D-Quant试剂盒(美国)对提取的总蛋白质进行定量分析。

1.4 蛋白质SDS-PAGE电泳初步检测菌根共生相关蛋白

采用SDS-PAGE不连续系统进行蛋白质组分分析，分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为5%。将40μL蛋白样品与10μL 5×Loading Buffer混匀后沸水浴5 min。取10μL上样，电泳条件为：浓缩胶80 V;分离胶120 V。使用考马斯亮蓝R-350染色，热染10 min。染色结束后用脱色液脱色至背景清晰为止。

1.5 双向电泳分离紫穗槐菌根蛋白

试验采用800μg和1 000μg两种蛋白上样量进行双向电泳。用水化液将蛋白质样品溶液定容至450μL，加入到上样槽中。然后选用pH值4～7的24 cm IPG预制干胶条，进行第一向等电聚焦。第一向等电聚焦结束后，将胶条平衡，放到第二向玻璃板中。加入低熔点琼脂糖封胶液，室温静置15 min后开始第二向电泳。电泳参数设定为：2 w/胶、电泳45 min;15 w/胶、电泳5～6 h;冷循环设定温度为16℃。凝胶采用考马斯亮蓝R-250和考马斯亮蓝R-350染色。

1.6 凝胶图谱扫描和分析

对脱色结束的聚丙烯酰胺凝胶进行扫描，分辨率为300 dp。用Gel-Pro analyzer软件进行 SDSPAGE胶条带分析，Image Master TM 2D Platinum(Version 7.0)进行双向电泳图谱分析。

2 结果与分析

2.1 双向电泳体系的建立

SDS-PAGE优化蛋白质提取：紫穗槐为多年生落叶丛生小灌木，其遗传特性和生物学特性都要比草本复杂，而且根部木质化较重，导致其根蛋白含量较叶片等部位低。常规的提取方法获得的蛋白含量低，导致很多低丰度蛋白无法分离及分析，对后续的试验研究造成很大的影响。试验运用SDS-PAGE电泳对TCA法和酚提取法对菌根侵染率达到90%以上的紫穗槐菌根蛋白提取、比较，结果如图1所示。

图1 SDS-PAGE电泳图

通过Gel-Pro analyzer软件对电泳图谱进行分析，结果表明A、B两泳道未检测到有效的条带，C泳道检测条带数为24条，D泳道检测条带数为25条。可见，酚提取法与TCA丙酮法具有显著的差异，蛋白条带数目明显多于TCA丙酮法。

将C与D泳道进行比较分析，其中出现3条表达量呈上升趋势的蛋白条带，图中标示为3、4、5，分子量分别为 78.2、65.7、33.6 KDa;1 条表达量呈下降趋势的蛋白条带，分子量分别为27.0 KDa;2条特异蛋白条带，图中标示为2、6，分子量分别为15.7、21.3 KDa。从SDS-PAGE差异条带可初步看出AM真菌与宿主植物共生后引起蛋白表达的变化。

蛋白质定量结果：通过GE公司2D-Quant试剂盒进行蛋白质定量，获得蛋白标准曲线如图2所示。

图2 蛋白质标准曲线

根据蛋白标准曲线图，计算酚提取法蛋白样品质量浓度。接种灭活AM真菌处理组的蛋白质量浓度为21.62 g/L;接种摩西球囊霉处理组的蛋白浓度为26.49 g/L。蛋白浓度完全满足双向电泳24 cm胶条对蛋白质样品的要求。

染色方法比较：蛋白质双向电泳染色方法主要分为两种：银染和考马斯亮蓝染色。银染灵敏度高，要求蛋白上样量少，但大多数银染方法与质谱不兼容［19］，常作为分析胶的染色方法。考马斯亮蓝染色较银染方法灵敏度低，要求较高的上样量，但考马斯亮蓝染色方法与质谱兼容性强，主要用于制备胶染色，便于做蛋白质的质谱鉴定。试验凝胶选用考马斯亮蓝R-250、R-350两种染色方法分析。电泳条件为：上样量1 000μg;第一向采用pH值4～7线性24 cm IPG胶条，第二向SDS-PAGE凝胶浓度为12%，结果如图3所示。

图3 紫穗槐根蛋白不同染色方法比较2-DE图

经 Image Master TM 2D Platinum(Version 7.0)对两块凝胶分析，考马斯亮蓝R-250染色获得426个蛋白斑点，考马斯亮蓝R-350染色获得442个蛋白斑点。同时，考马斯亮蓝R-350染色后的凝胶胶块背景较浅，蛋白质点之间边界清晰。而且考马斯亮蓝R-350较考马斯亮蓝R-250染色还具有时间短，操作简便的优点。

综上所述，将考马斯亮蓝R-350染色方法作为2-DE体系的首选染色方法。

不同上样量比较：过高的上样量会造成很多高丰度蛋白掩盖低丰度蛋白，从而丢失低丰度蛋白信息。而上样量过低会使很多低丰度蛋白无法在凝胶图谱中显示出来，同样会丢失低丰度蛋白信息，但低丰度蛋白往往是生命活动中起重要作用的功能蛋白［20］，同时也最有可能是在菌根共生的信号传导中起关键性作用的信号因子。故选择合适的上样量对获得分辨率高的凝胶图谱至关重要。试验选择800 μg和1 000μg两种上样量，第一向采用pH值4～7线性24 cm IPG胶条，第二向SDS-PAGE凝胶浓度为12%，考马斯亮蓝R-350染色，结果如图4所示。

图4 紫穗槐根蛋白不同上样量比较2-DE图

经3次平行实验，获得重复性好的图谱。上样量1 000μg时检测到的蛋白斑点数目与上样量800 μg时检测到蛋白斑点基本相同。但上样量1 000 μg时检测到的蛋白数量较多，且蛋白斑点多呈椭圆形，聚焦效果好，如图4所示。本研究表明，紫穗槐菌根蛋白中含有大量低丰度蛋白，而且后续还要进行质谱操作，要求蛋白量大，故选用1 000μg作为后续试验的参考上样量。

2.2 紫穗槐根蛋白2－DE分析

采用优化后的2-DE体系对接种AM真菌紫穗槐侵染率90%以上时的菌根蛋白进行分析。凝胶图谱经Image Master TM 2D Platinum(Version 7.0)软件过滤背景，通过 Smooth、Min area、Saliency参数对凝胶图像上的蛋白点进行对齐、点的匹配分析，结果如图5所示。

图5 紫穗槐菌根蛋白2-DE图谱分析

经过3次重复分析可知接种灭活AM真菌处理CK组共获得419个蛋白点，接种AM真菌处理GM组共获得434个蛋白点。紫穗槐菌根蛋白双向电泳图谱表明AM真菌侵染率90%以上紫穗槐菌根蛋白质点的分子量范围在14.4～96.0 kDa，但主要集中在14.4～66.2 kDa分子量范围区域内，等电点范围为 4.2～6.5。

通过 Image Master TM 2D Platinum(Version 7.0)软件分析显示，不同处理组蛋白共有32个蛋白点的表达丰度变化差异显著(P＜0.05)。其中14个蛋白点上调表达，Sport number分别为：8、9、11、12、13、20、21、24、26、27、28、29、30、32;3 个蛋白点下调表达，Sport number分别为：1、18、19;15 个蛋白点仅在GM 处理组中表达，Sport number分别为：2、3、4、5、6、7、10、14、15、16、17、22、23、25、31。

3 结论与讨论

SDS-PAGE结果表明，酚提取法蛋白条带数目明显多于TCA丙酮法，具有显著的差异。本研究进一步优化了常规酚提取法，减少了实验步骤，从而减少人为操作造成的蛋白量的损失;将紫穗槐根组织与提取液与Tris-饱和酚一同研磨并增加了研磨时间，使样品破碎更完全，而加入提取液进行研磨又可以增加其与样品蛋白的作用时间，使提取效果更佳。

针对与质谱兼容的考马斯亮蓝染色方法入手，本研究对R-350和R-250两种染色法进行分析。结果表明，R-350染色后的凝胶胶块背景较浅，蛋白质点之间边界清晰。而且考马斯亮蓝R-350较考马斯亮蓝R-250染色还具有时间短，操作简便的优点，故试验选择染色效果好的R-350作为2-DE体系的染色方法。

试验选用800μg和1 000μg两种常用蛋白上样量。上样量为1 000μg时检测到的蛋白数量较多，蛋白斑点多呈椭圆形，聚焦效果好。在研究中发现紫穗槐含有大量低丰度蛋白，而后续质谱鉴定对蛋白含量要求比较大，故选用1 000μg作为后续试验的参考上样量。

采用优化的2-DE体系分析了紫穗槐菌根侵染率达90%以上的菌根蛋白。结果表明，在双向电泳图像上检测到400多个蛋白点，其中上调表达蛋白点14个，下调表达蛋白点3个，特异表达蛋白点15个。

在AM真菌与植物互作的过程中，AM真菌作为外源真菌会诱导植物的防御反应［4，6］。一系列蛋白类激酶或者多肽类会参与到植物防御反应中［21-22］。因此推测上调的蛋白斑点可能与增加植株的抗逆性方面有关，抗逆性可以很好地保护宿主植物免受外源性侵害。而当AM真菌与宿主植物达成一致协议后，宿主植物会对有益内共生真菌-AM真菌打开防御门户［23］，因此下调的蛋白斑点多肽可能为一些与防御性有关的蛋白。特异表达蛋白点可能为AM真菌蛋白，也可能是真菌与宿主植物之间的信号蛋白。这些差异表达的蛋白，均由AM真菌共生诱导，可能参与菌根形成过程的信号传导，或者丛枝形成后的营养运输，后续工作将对此加强研究。

基于双向电泳胶的局限性，低丰度蛋白、碱性蛋白以及非极性的膜蛋白都不能在常规2-DE上分离出来［24］，因此本试验分离出来的都是可溶性蛋白，其含量在植物体内代谢过程中的变化可以反映细胞内蛋白合成、变性和降解等方面的信息。在AM真菌同宿主植物互作后，宋鸽等［6］报道了接种AM真菌增加可溶性蛋白的含量，而且随着菌根共生体的建立，产生一些新的蛋白［25］，原因可能是在AM真菌和宿主植物互作过程中，宿主植物细胞组织基因表达发生时空变换，某些基因(如共生相关基因、病程相关蛋白基因)会被诱导表达而产生相应的蛋白质，如参与防御的几丁质酶基因，参与信号传导的磷酸化底物，参与基因转录的转录因子，以及参与细胞形态改变的细胞骨架蛋白;同时又存在消失的蛋白，某些相关基因的表达会被抑制或推迟，甚至是原来的蛋白质被降解，以便附着泡、丛枝、泡囊、入侵栓等特征结构的形成，最后完成丛枝菌根真菌的内共生。

［1］田兴军.东北木本植物［M］.香港：乐斯国际出版社，1992.

［2］李品明，杨晓红，马永甫.杂草发酵液甲醇溶提物对离体AMF生长的效应［J］.西南农业大学学报：自然科学版，2004，26(4)：459-466.

［3］AugéR M.Water relations，drought and vesicular arbuscular mycorrhizal symbiosis［J］.Mycorrhiza，2001，11：3-42.

［4］Fuqiang Song，Ge Song，Dong A R，et al.Regulatory mechanisms of host plant defense responses to arbuscular mycorrhiza［J］.Acta Ecologica Sinica，2011，31：322-327.

［5］Song F Q，Tian X J，He X B，et al.The influence of desert false indigo，amorpha fruticosa and three arbuscular mycorrhizae fungi on the growth of Populus ussuriensis seedlings［J］.New Forests，2009，37：265-273.

［6］宋鸽，宋福强.AM真菌和紫穗槐苗互作早期宿主防御生理指标的响应特征［J］.林业科学，2011，47(10)：44-50.

［7］钱小红，贺福初.蛋白质组学：理论与方法［M］.北京：科学出版社，2003：10-12.

［8］Chen S，Harmon A C.Advances in plant proteomics［J］.Proteomics，2006，20(6)：5504-5516.

［9］Bona E，Marsano F，Massa N，et al.Proteomic analysis as a tool for investigating arsenic stress in pteris vittata roots colonized or not by arbuscular mycorrhizal symbiosis［J］.J Proteomics，2011，74(8)：1338-1350.

［10］Colditz F，Braun H P.Medicago truncatula proteomics［J］.J Proteomics，2010，73(10)：1974-1985.

［11］Bona E，Marsano F，Massa N，et al.Proteomic analysis as a tool for investigating arsenic stress in pteris vittata roots colonized or not by arbuscular mycorrhizal symbiosis［J］.JProteomics，2011，74(8)：1338-1350.

［12］徐超，吴小芹，林司曦，等.马尾松根部蛋白双向电泳分离体系的构建［J］.南京林业大学学报：自然科学版，2011，35(1)：16-18.

［13］范吉星，邓用川，黄惜，等.红海榄根部总蛋白质提取方法的改进和双向电泳体系的建立［J］.湖南农业大学学报：自然科学版，2008，34(5)：550-553.

［14］张小果，乔桂荣，李翠云，等.旱柳根系蛋白质双向电泳体系的建立［J］.浙江农林大学学报，2011，28(4)：653-661.

［15］郑蕊，岳思君，韩璐，等.枸杞花药蛋白质组双向电泳体系的建立及应用［J］.西北植物学报，2011，31(12)：2443-2448.

［16］Schenkluhn L，Hohnjec N，Niehaus K，et al.Differential gel electrophoresis(DIGE)to quantitatively monitor early symbiosis and pathogenesis-induced changes of the Medicago truncatula root proteome［J］.J Proteomics，2010，73(4)：753-768.

［17］Recorbet G，Valot B，Robert F，et al.Identification of in planta-expressed arbuscular mycorrhizal fungal proteins upon comparison of the root proteomes of medicago truncatula colonised with two glomus species［J］.Fungal Genet Biol，2010，47(7)：608-618.

［18］Phillips JM，Haymen D S.Imprived procedures for clearing and staining parasitic and vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi for rapid，assessment of infection［J］.Trans Br Mycol Soc，1970，55：158-161.

［19］Caandiano G，Bruschi M，Musante L，et al.Blue silver：a very sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteome analysis［J］.Electrophoresis，2004，25(9)：1327-1333.

［20］梁文裕，王星，焦广飞，等.发菜蛋白质组双向电泳技术的建立及优化［J］.西北植物学报，2009，29(8)：1550-1556.

［21］Underwood W.The plant cell wall：a dynamic barrier against pathogen invasion［J］.Front Plant Sci，2012(3)：85.

［22］Shen Q，Bao M，Zhou X.A plant kinase plays roles in defense response against geminivirus by phosphorylation of a viral pathogenesis protein［J］.Plant Signal Behav，2012，7(7)：21-24.

［23］Kereszt A，Kondorosi E.Plant science unlocking the door to invasion［J］.Science，2011，6019(331)：865-866.

［24］Rabilloud T，Chevallet M，Luche S，et al.Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics：past，present and future［J］.J Proteomics，2010，73(11)：2064-2077.

［25］宋鸽.AM真菌对紫穗槐防御性调控及共生相关蛋白的SDSPAGE分析［D］.哈尔滨：黑龙江大学，2011.