刘宇炜，黄 丹，陈晓青，许晓利，艾永循

（江汉大学 医学院，湖北 武汉 430056）

甘氨酸对大鼠前额叶皮质锥体神经元串连动作电位影响的研究

刘宇炜，黄 丹，陈晓青，许晓利，艾永循

（江汉大学 医学院，湖北 武汉 430056）

目的：研究甘氨酸对大鼠前额叶皮质锥体神经元串连动作电位的影响。方法：大鼠前额叶皮质切片，全细胞膜片钳记录锥体神经元串连动作电位。结果：甘氨酸（300 μmol∕L）可显著降低大鼠前额叶皮质锥体神经元串连动作电位的发放频率，其作用可被番木鳖碱（1 μmol∕L）所阻断，表明其作用部位为番木鳖碱依赖性甘氨酸受体。甘氨酸还引起膜超极化，延长动作电位的潜伏期，加快复极化进程。结论：前额叶皮质的甘氨酸受体可能在VTA-NAcc-PFC神经环路的调控中发挥重要作用。

甘氨酸；前额叶皮质；动作电位

前额叶皮质（prefrontal cortex，PFC）在许多高级神经系统活动中起关键的作用［1］，它是脑内奖赏回路的一个重要组成部分，与腹侧被盖区（ven⁃tral tegmental area，VTA）及伏隔核（nucleus accum⁃bens，NAcc）之间存在着非常密切的交互联系［2］。前额叶皮质损伤可能导致行为失控与情绪异常［3］，并且与药物成瘾性行为密切相关［4］。

甘氨酸（glycine，Gly）是人体中枢神经系统内一种重要的抑制性神经递质，对人体多项生理功能有重要的调节作用［5］。通过结合到甘氨酸受体，甘氨酸能促进快速的氯离子电流。甘氨酸受体主要分布在脊髓、延髓，其在脑干、皮质等处的表达也有报道［6］，但其对前额叶皮质的调控作用研究尚不明确，本实验旨在探讨甘氨酸对前额叶皮质锥体神经元串连动作电位的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

Sprague-Dawley大鼠，鼠龄17～30天，雌雄不限，由江汉大学医学院医学实验动物中心提供。

甘氨酸（glycine）和番木鳖碱（strychnine）购自Sigma公司，其余试剂为国产分析纯。

孵育液（mmol∕L）：glycerol 250，KCl 1.6， NaH2PO41.2，MgCl21.2，CaCl22.4，NaHCO325，glucose 11，调pH值至7.3。

人工脑脊液（ACSF）（mmol∕L）：NaCl 125，KCl 1.6，NaH2PO41.2，MgCl21.2，CaCl22.4，NaHCO325，glucose 11，调pH值至7.3。

电极内液（mmol∕L）：K gluconate 135，KCl 5，MgCl22，HEPES 10，Mg ATP 2，GTP 0.2，调pH值至7.2。

1.2 方法

1.2.1 大鼠前额叶皮质脑片的制备 参照笔者以前的实验方法［7］，并在此基础上稍加改进：无菌条件下迅速将大鼠断头取脑，置于混合气（95%O2∕5%CO2）饱和的冰冷（0～4℃）孵育液中约5 min。在0℃通混合气条件下，采用振动切片机（VF-300，美国Precisionary公司）将前额叶皮质脑组织切成250 μm厚的冠状切片，置于混合气饱和的孵育液中，室温（22～24℃）下孵育至少1 h以上。

1.2.2 电生理记录 玻璃微电极由P-97电极拉制仪（美国Sutter公司）分两步拉制，充灌电极内液后阻抗为4～6 MΩ。将脑片置于操作台正中约0.4 mL凹槽内，用一铂金环压住。BX51正置显微镜（日本奥林巴斯公司）下选大鼠前额叶皮质锥体神经元。全细胞膜片钳记录所用仪器为Axo⁃patch 700B膜片钳放大器（美国Molecular公司），在电极与细胞膜之间形成高阻（1～5 GΩ）封接后，进一步将膜吸穿，调节电容和串联电阻补偿。数据以5 kHz过滤，使用Axonscope 1.1.1 acquisition软件通过Axon DigiData-1440A记录于电脑上。整个记录过程中采用混合气饱和的人工脑脊液持续灌流，灌流速度约2 mL∕min。

1.2.3 统计学分析 采用Sigmaplot 11.0（Jandel Scientific）和SPSS 16.0进行处理、统计分析和制图。实验结果以均值±标准误(±S)表示，统计结果采用配对t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 甘氨酸降低前额叶皮质锥体神经元串连动作电位数量

本实验所用的78个PFC神经元均为锥体形，直径约15～35 μm，静息膜电位范围为-49～-75 mV。93.5%的细胞对外加甘氨酸（300 μmol∕L）敏感。如图1A所示，给予400 ms时长的去极化电流脉冲可引起一定数量的串连动作电位，每次脉冲之间间隔为30 s。为便于比较，本研究将初始阶段对照组引出的动作电位数目控制为6个（外加去极化电流50～100 pA）。待其稳定后，持续记录5 min，然后灌流甘氨酸（300 μmol∕L）3 min，甘氨酸能明显减少串连动作电位数量。停止给药后继续用人工脑脊液灌流，串连动作电位数量逐渐直至完全恢复，表明甘氨酸的作用为可逆性的。

提前持续给予一种甘氨酸受体拮抗剂——番木鳖碱（strychnine，Str）（1 μmol∕L）情况下，再重复上述实验（图1），研究发现甘氨酸不再引起串连动作电位数量变化，其抑制作用被番木鳖碱所阻断，表明其在前额叶皮质锥体神经元上作用部位为番木鳖碱依赖性的甘氨酸受体作用位点。

2.2 甘氨酸对前额叶皮质锥体神经元动作电位特性的影响

图1 甘氨酸降低前额叶皮质锥体神经元串连动作电位数量

如图2A所示，本研究将甘氨酸作用前后的串连动作电位重叠放在一起比较，发现甘氨酸（300 μmol∕L）作用后，引起细胞膜电位发生一定程度超极化，静息膜电位值降低；动作电位高度未发现显著性改变；第1次引起动作电位的时间（潜伏期）明显延长，药物作用达到最大后，同样条件的去极化电流仅能引起两次动作电位，接下来的近250 ms去极化电流均不能刺激动作电位的发放。研究进一步将甘氨酸作用前后的动作电位做平均化处理，将两个平均化之后动作电位再做标准化（normalization）叠加在一起（图2B）。可以看到，甘氨酸作用之后，动作电位的去极化进程未见明显变化，而复极化过程加快；动作电位半幅时程（half-width）值有所减小。

图2 甘氨酸对前额叶皮质锥体神经元动作电位特性的影响

以上统计结果详见表1。

表1 甘氨酸（300μmol/L）对前额叶皮质锥体神经元动作电位特性的影响

3 讨论

甘氨酸是中枢神经内重要的抑制性递质，但其也有兴奋性功能。一种情况是作为辅助激动剂（co-agonist）参与激动NMDA受体；另一种情况是在中枢神经神经系统大部分区域，新生两周以内，细胞内Cl-浓度比胞外高，GABA和甘氨酸作用下能引起Cl-外流而产生兴奋性作用，两周以后则由于胞内Cl-浓度的下降而转变成抑制性作用［8］。

中脑腹侧被盖区、伏隔核和前额叶皮质及其递质联系形成的脑奖赏环路（VTA-NAcc-PFC神经环路）是药物奖赏效应产生的重要解剖学基础，成瘾的中枢作用位点大部分集中于此环路，而学习与记忆则集中于海马、杏仁体和皮质，所有这些区域均参与了成瘾、学习与记忆中起关键作用的环路［10］。其中，前额叶皮质直接接受来自腹侧被盖区的多巴胺（Dopamine，DA）能神经纤维支配，与以上情感行为、学习与记忆等诸多脑的高级功能密切相关，而前额叶皮质反过来又与腹侧被盖区和伏隔核有广泛的交互联系［1-4］。这一环路在生理与病理过程中发挥着非常重要的作用。前额叶皮质损伤或异常调节可能导致行为失控与情绪异常［3］，并且与药物成瘾性行为密切相关［4］。

以前有文献报导番木鳖碱敏感的甘氨酸受体存在于新生大鼠的前额叶皮质［9］，一般认为成年后，这些甘氨酸受体就消失了。通过对17～30天SD大鼠作脑片膜片钳记录，本研究发现，具有功能活性的甘氨酸受体在成年的SD大鼠前额叶皮质仍然存在。在给予甘氨酸（300 μmol∕L）情况下，其对动作电位的影响为抑制作用，表明其增加Cl-内流，进而引起细胞膜超极化，使神经元兴奋性降低，而导致同样条件下去极化电流引起的串连动作电位数量减少。其作用可被番木鳖碱（1 μmol∕L）所阻断，证实在前额叶皮质锥体神经元上存在有功能性的番木鳖碱依赖性甘氨酸受体，这对于调节前额叶皮质的功能有重要的意义。进一步分析动作电位的特性，甘氨酸可延长动作电位的潜伏期，加快复极化进程，表明其作用可能主要提高了K+外流速度。

牛磺酸（taurine）是一种广泛存在于中枢神经系统范围内的内源性甘氨酸受体激动剂，其作用与甘氨酸类似。由于有番木鳖碱依赖性甘氨酸受体的存在，在生理或病理条件下，牛磺酸可通过对前额叶皮质锥体神经元的影响，可能对VTANAcc-PFC神经环路的调控起到重要的作用，其具体的作用机制有待进一步研究。

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Effects of Glycine on Trains of Action Potentials in Pyramidal Neurone of Rat Prefrontal Cortex

LIU Yu-wei，HUANG Dan，CHEN Xiao-qing，XV Xiao-li，AI Yong-xun
（School of Medicine，Jianghan University，Wuhan 430056，Hubei，China）

Objective：To study the effect of glycine on trains of action potentials in pyramidal neurone of rat prefrontal cortex.Methods：Rat prefrontal cortex slices were prepared.Trains of ac⁃tion potentials were investigated using whole-cell patch-clamp recording in pyramidal neurone.Results：The frequency of trains of action potentials in pyramidal neurone was decreased significant⁃ly by 300 μmol∕L glycine，this effect could be blocked by 1 μmol∕L strychnine，demonstrating that it acts on strychnine-dependent glycine receptors.The glycine can cause membrane hyperpolariza⁃tion，prolong the latent period of action potential，accelerate the repolarization process.Conclusion：The glycine receptors in prefrontal cortex may involve in important function in regulation of VTA-NAcc-PFC neural circuit.

glycine；prefrontal cortex；action potential

R338.2-33

A

1673-0143（2012）06-0049-04

（责任编辑：范建凤）

2012－09－13

湖北省自然科学基金重点项目（2008CDA053）；武汉市科技计划项目（201250499145-27）

刘宇炜（1973—），男，副教授，博士，研究方向：神经生物学。