刘建业（山西省儿童医院药剂科，山西 太原 030013）

祛腐再生膏为医院自制中药制剂，由当归、白芷、紫草等6味药材组成，具有活血止痛、祛腐生肌的功效，用于疮疡溃烂、脓腐不脱、疼痛不止、新肌难生者。本品原标准只收载了当归的TLC鉴别，缺少科学的定性、定量标准，不利于产品的质量控制。为有效地控制祛腐再生膏的质量，按照《医疗机构制剂注册批件》备注项下的要求，我们对其制剂中的当归、白芷进行定性分析，采用高效液相色谱法对藁本内酯进行含量测定。

1 仪器与试药

Waters高效液相色谱仪（1525 泵、2487 紫外检测器）；CPA225D电子天平（德国赛多利斯）。藁本内酯对照品（中国食品药品检定研究院，批号 110756-200110）；祛腐再生膏（批号110701，110702，110703，111201，111202，111203）及阴性样品均自制。甲醇、三氟乙酸为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 TLC鉴别

图1 当归薄层色谱图1-阴性；2-祛腐再生膏；3-当归对照药材Fig 1 TLC of Radix Angelicae Sinensis1-negative sample without Radix Angelicae Sinensis; 2 -Qufuzaisheng ointment; 3-Radix Angelicae Sinensis

2.1.1 当归的鉴别 取本品10 g，加甲醇30 mL，加热使溶解，超声30 min，4 ℃冷藏4 h，滤过，滤液蒸干，残渣加水25 mL，超声使溶解，滤过，滤液用乙酸乙酯振摇提取2次，每次25 mL，分取乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。另取当归对照药材0.2 g，加甲醇20 mL，超声处理30 min，滤过，滤液浓缩至1 mL，作为对照药材溶液。照薄层色谱法（2010年版《中国药典》一部 附录ⅥB）实验，吸取上述两种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（10∶1∶0.1）为展开剂，展开，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，见图1。

2.1.2 白芷的鉴别 取本品10 g，加甲醇30 mL，加热搅拌使溶解，超声30 min，4 ℃冷藏4 h，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醚1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取白芷对照药材2 g，加麻油20 mL，加热至药材成黄褐色，趁热滤过，放冷，加甲醇20 mL，置分液漏斗中，分取上层液，蒸干，残渣加乙醚1 mL使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法（2010年版《中国药典》一部 附录ⅥB）实验，吸取上述两种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（60～90℃）-乙醚（1∶4）为展开剂，预饱和15 min，展开，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加热10 min，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点，见图2。

图2 白芷薄层色谱图1-阴性；2-白芷对照药材；3-祛腐再生膏Fig 2 TLC of Radix Angelicae Dahuricae1-negative sample without Radix Angelicae Dahuricae; 2-Radix Angelicae Dahuricae; 3-Qufuzaisheng ointment

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Diamonsil C18柱（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.05%三氟乙酸水（58∶42）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：328 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。

2.2.2 溶液的制备 （1）对照品溶液的制备：取藁本内酯对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含20.3 μg的溶液，即得对照品溶液。（2）供试品溶液的制备：取装量差异项下的本品内容物约10 g，精密称定，置250 mL烧瓶中，加水100 mL，连接挥发油提取器，自提取器上端加水使充满刻度部分，并溢流入烧瓶为止，再加乙酸乙酯3 mL，加热回流1 h，放冷，分取乙酸乙酯层，挥发油提取器用甲醇适量洗涤，合并乙酸乙酯和甲醇液，通过铺有0.5 g无水硫酸钠的漏斗，用甲醇适量洗涤数次，合并于5 mL的容量瓶中，再加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。（3）阴性样品溶液的制备：按处方比例，按照祛腐再生膏的制备工艺制备缺当归的阴性样品，再按供试品溶液的制备方法制成阴性样品溶液。

2.2.3 系统适用性实验 取对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液，按上述色谱条件测定，结果表明，供试品中藁本内酯与相邻成分基本分离，且阴性对照无干扰，见图3。

图3 HPLC的色谱图A-对照品溶液；B-祛腐再生膏；C-阴性样品溶液；1-藁本内酯Fig 3 HPLC chromatogramsA-reference substance; B-Qufuzaisheng ointment; C-negative sample; 1-ligustilid

2.2.4 方法学考察 （1）线性范围：分别精密吸取浓度为20.3 μg·mL-1的藁本内酯对照溶液2，5，10，20，50，75，100 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，以对照品的进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，进行回归，得回归方程Y= 2.17×106X＋3 026.6，r=0.999 8，结果表明，在0.040 6～2.03 μg范围内，藁本内酯峰面积与进样量呈良好的线性关系。

（2）精密度实验：精密吸取对照品溶液，连续进样6次，测定峰面积，结果RSD为0.72%，表明仪器精密度良好。

（3）重复性实验：取本品，照“供试品溶液的制备”项下方法制备供试品溶液6份，按上述色谱条件测定，计算得藁本内酯的平均含量为0.015 3 mg·g-1，RSD为1.43%，表明该法重复性良好。

（4）稳定性实验：取同一供试品溶液分别于0，2，4，8，12 h进样20 μL，记录色谱图，测定结果，结果藁本内酯在12 h内基本稳定，RSD为1.63%。

（5）回收率实验：取已知含量的同一批样品9份（藁本内酯的含量为0.015 1 mg·g-1），每份约5 g，精密称定，按表1精密加入浓度为20.3 μg·mL-1藁本内酯对照品溶液适量，制备成供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，计算回收率，平均回收率为98.26%，RSD = 2.48%（n= 9），结果见表1。

表1 加样回收率实验结果.n = 9Tab 1 Results of recovery.n = 9

2.2.5 样品含量测定 取6批祛腐再生膏（批号为110701，110702，110703，111201，111202，111203），按“供试品溶液的制备”项下方法制备各供试品溶液，分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，根据峰面积采用外标法计算含量，结果见表2。

3 讨论

3.1 本研究增加了白芷的TLC鉴别；修订了当归的TLC鉴别；增加了当归中藁本内酯的HPLC含量测定。研究中也考察了紫草的TLC鉴别，但因紫草在方中用量较少，分离度不好，阴性有干扰，未收录到文中。

表2 祛腐再生膏中藁本内酯的含量测定结果.n = 3Tab 2 Content determination of ligustilid in Qufuzaisheng ointment.n = 3

3.2 由于藁本内酯为挥发性成分，性质不稳定，容易发生异构化[1]，且本品为软膏剂，为保证提取率及藁本内酯的稳定性，我们分别采用回流提取、超声提取、挥发油提取法，并对提取时间进行了考察。结果表明，采用挥发油提取器提取45 min，对藁本内酯的提取效果最好。我们比较了在甲醇-三氟乙酸水[2]、乙腈-磷酸水[3]、甲醇-乙腈-磷酸水[4]、甲醇-异丙醇水[5]等不同溶液系统中的色谱分离能力，结果流动相为甲醇-0.05%三氟乙酸水时可得到较好的色谱分离效果。

3.3 本实验中的藁本内酯回收率偏低且RSD相对较大，可能是由于其溶液在室温下不稳定易发生异构化所致，而其在挥发油中基本稳定，不会出现纯品的异构化反应，这可能是挥发油中含有一定量的藁本内酯异构化产物，使异构化反应趋于平衡所致[1]。另据文献报道，藁本内酯在甲醇中稳定性良好[5]，故本文采用挥发油提取器提取，以甲醇作为溶剂及流动相，提高了外标法定量测定中药制剂中藁本内酯含量的准确性。同时，本试验的结果显示，随着贮存时间的延长，本品中藁本内酯的量会降低，这可能与其本身不稳定且具有挥发性有关。因此，建议在本品的储藏过程中，尽量低温避光保存，且不宜贮存时间过长。

[1] 李桂生，马成俊，李香玉，等.藁本内酯稳定性研究及异构化产物的GC-MS分析[J].中草药，2000，31（6）：405-407.

[2] 文红梅，彭国平，朱国元，等.HPLC内标法同时测定坤血安软胶囊中藁本内酯和6-姜酚的含量[J].中成药，2007，29（3）：371-374.

[3] 容穗华，林海，高妮.不同产地当归中主要有效成分的含量测定[J].当代医学，2011，17（22）：140-141.

[4] 刘勇，韩桂茹，封淑华.HPLC 法同时测定归脾丸中甘草酸与藁本内酯[J].中成药，2012，34（4）：667-669.

[5] 汪程远，张浩，钱忠明.HPLC测定不同川芎药材中藁本内酯[J].中草药，2006，37（3）:447-449.