王洪武， 李守超， 王光勇， 余枫华， 曾 晓， 狄国杰， 徐媛青， 袁 丁，张长城*

(1.三峡大学医学院，湖北宜昌443002;2.宜昌市夷陵区人民医院，湖北宜昌443100;3.宜昌市疾病预防控制中心，湖北宜昌443003)

环磷酰胺是临床用于肿瘤化疗的常用药物，但其骨髓抑制、免疫低下等毒副作用限制了环磷酰胺在临床的广泛使用。五子衍宗方由枸杞子、菟丝子 (炒)、覆盆子、五味子 (蒸)、车前子 (盐炒)组成，具有补肾益精之功效，本课题近期研究显示五子衍宗方具有较好的免疫调节作用，可显著改善环磷酰胺所致免疫低下小鼠的免疫功能［1］。但五子衍宗方能否减轻环磷酰胺在肿瘤化疗过程中的毒副作用尚未明晰，本研究拟建立H22荷瘤小鼠模型，采用环磷酰胺联合五子衍宗方治疗，以研究五子衍宗方对环磷酰胺化疗的减毒作用。

1 材料

1.1 试剂 流式荧光抗体Anti-Mouse CD19(FITC)，Anti-MouseCD69(PE-Cy5)，Anti-Mouse CD4(PE)，Anti-Mouse CD8a(FITC)，以上试剂均购于 eBioscience公司，批号Cat.11-0191。

1.2 动物 BalB/c种雄性小鼠，SPF级，8～9周龄，22～25 g，湖北省实验动物中心提供，动物生产许可证号SCXK(鄂)2008-0005。

1.3 药物 五子衍宗方由枸杞子、菟丝子、覆盆子、五味子、车前子组成，全部生药经三峡大学医学院汪鋆植教授鉴定为正品，取枸杞子400 g，菟丝子 (炒)400 g，覆盆子200 g，五味子 (蒸)50 g，车前子 (盐炒)100 g，按照传统方法煎取，浓缩至粉末，提取率为40.7%，临用前配成相应浓度的溶液;注射用环磷酰胺 (环磷酰胺)，规格为0.2 g，批号08121021，江苏恒瑞医药股份有限公司。

1.4 仪器 超净工作台 (上海博讯实业有限公司医疗设备厂);CKX41型倒置显微镜 (日本OLYMPUS公司);XW-80A微型旋涡混合仪 (上海沪西分析仪器厂有限公司);TD-WS湘仪离心机 (孝感市宏业医用仪器有限公司);JA2003型电子分析天平 (上海天平仪器厂);流式细胞仪(美国BD FACACalibur)。

2 方法

2.1 H22荷瘤小鼠模型的建立 无菌条件下，将复苏的H22肝癌细胞注入小鼠腹腔，7 d后抽取小鼠腹水，并用无菌PBS稀释4倍，反复冲打、并混匀，在显微镜下计数，用PBS调整细胞浓度至3×107mL－1，取0.1 mL于各小鼠右侧腋窝下碘伏消毒后皮下接种，从接种第一只小鼠开始到最后一只的总时间控制在30 min内。

2.2 分组及给药 实验小鼠接种H22后，随机分为4组，每组10只，即荷瘤对照组、环磷酰胺组、环磷酸胺加五子衍宗方高剂量组 (840 mg/kg)、环磷酸胺加五子衍宗方低剂量组 (420 mg/kg)。各组于接种第2天分别灌胃给药。环磷酸胺组、环磷酸胺加五子衍宗方高剂量组和环磷酸胺加五子衍宗方低剂量组分别给予小鼠腹腔注射环磷酰胺50 mg/kg，隔天1次，共注射5次;环磷酸胺加五子衍宗方高剂量组和环磷酸胺加五子衍宗方低剂量组分别给予五子衍宗方提取物840 mg/kg(生药量为2.06 g/kg)和420 mg/kg灌胃 (生药量为1.03 g/kg)，每天1次，共10次;荷瘤对照组与环磷酸胺组给予等剂量生理盐水灌胃。

2.3 外周血WBC、RBC、PLT数量检测 末次给药24 h后，小鼠眼眶静脉丛取血，测血象，检测指标为白细胞总数 (WBC)，红细胞总数 (RBC)，血小板总数 (PLT)。

2.4 骨髓有核细胞计数 取小鼠一侧完整股骨，除净软组织，用PBS将全部骨髓冲洗至离心管，定容至5 mL。计数板计数，调整细胞浓度为3×107mL－1。

2.5 脏器指数及抑瘤率的测定 末次给药24 h后称定质量，处死小鼠，取脾并称湿质量，以小鼠脾质量/体质量(mg/g)作为脾脏指数。并剥离瘤块，称瘤质量，按平均瘤质量计算抑瘤率。

抑瘤率 (%)=(对照组平均瘤质量－治疗组平均瘤质量)/对照组平均瘤质量×100%

2.6 小鼠脾脏细胞绝对计数 取小鼠脾脏，置于覆盖有200目钢网的10 mL小烧杯上，用1 mL pH 7.3的PBS润湿钢网，另取用1 mL pH 7.3的PBS润湿脾脏，眼科剪剪碎，并用注射器橡胶塞将小鼠脾脏碾碎，用2 mL PBS将碾碎后小鼠脾脏冲入小烧杯内，制成脾细胞悬液，离心、弃上清加2 mL红细胞裂解液，涡旋仪混匀，避光孵育5～8 min，离心、弃上清，加3 mL PBS重悬，离心、弃上清，加3 mL PBS重悬，再离心、弃上清，用8 mL PBS重悬，调整脾脏细胞浓度为1×107/mL，细胞计数板计数。

2.7 流式细胞仪检测脾中CD4+、CD8+和CD4+CD69+数量，及CD19+细胞数量 取上述制备的脾脏细胞悬液400 μL，流式细胞术检测首先在FFC和SSC中圈选淋巴细胞，再圈选细胞，CD4+T、CD8+T细胞和CD19+T细胞并检测细胞比例，同样步骤检测CD4+CD69+比例。将各亚群的比例和细胞总数，换算成其各亚群绝对数量［2］。

2.8 统计学分析 采用SPSS 13.0软件进行统计，资料数据用均数±标准差 (±s)表示，采用t检验观察其组间差异。

3 实验结果

3.1 对环磷酰胺化疗荷瘤小鼠WBC、RBC、PLT及骨髓有核细胞数量的影响 环磷酰胺组外周血红细胞、白细胞、血小板数量较荷瘤对照组显著性减少，小鼠骨髓有核细胞数量较荷瘤对照组亦显著降低;环磷酰胺加五子衍宗方高、低剂量组小鼠外周血红细胞、白细胞、血小板数量较环磷酰胺组小鼠显著增加，骨髓有核细胞数量亦比环磷酰胺组明显增多。结果见表1。

表1 对环磷酰胺化疗荷瘤小鼠WBC、RBC、PLT及骨髓有核细胞数量的影响(±s，n=10)

表1 对环磷酰胺化疗荷瘤小鼠WBC、RBC、PLT及骨髓有核细胞数量的影响(±s，n=10)

注:与荷瘤对照组相比，##P＜0.01;与环磷酰胺组相比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

组 别 剂量/(g·kg－1)WBC/(×109·L－1)RBC/(×1012·L－1)PLT/(×109·L－1) 骨髓有核细胞数量/×106荷瘤对照组 － 2.90±0.24 4.38±0.11 803.00±21.82 862.85±126.98环磷酰胺组 0.05 1.38±0.16## 3.56±0.06## 676.00±31.12## 486.25±97.54#环磷酰胺+五子衍宗方组(低剂量) 0.05+0.42 1.66±0.24##* 3.74±0.09##* 711.00±25.58##* 535.00±32.08#环磷酰胺+五子衍宗方组(高剂量) 0.05+0.84 1.67±0.32##* 3.88±0.08##* 794.00±32.19＊＊ 673.75±78.24#*

3.2 对环磷酰胺化疗荷瘤小鼠瘤质量和抑瘤率的影响环磷酰胺加五子衍宗方高、低剂量组和环磷酰胺组小鼠瘤质量明显低于荷瘤对照组;环磷酰胺加五子衍宗方高、低剂量组小鼠瘤质量均低于单独使用环磷酰胺组。但无统计学差异，提示五子衍宗方对环磷酰胺抑瘤率无负向影响。结果见表2。

表2 对H22荷瘤小鼠瘤质量和抑瘤率的影响(±s，n=10)

表2 对H22荷瘤小鼠瘤质量和抑瘤率的影响(±s，n=10)

注:与荷瘤对照组相比，##P＜0.01;与环磷酰胺组相比，＊＊P＜0.01。

组别 剂量/(g·kg －1)平均瘤质量/g平均抑瘤率/%荷瘤对照组 － 1.73±0.19＊＊ －环磷酰胺组 0.05 0.80±0.15## 53.55环磷酰胺+五子衍宗方组(低剂量) 0.05+0.42 0.77±0.10## 55.4957.95环磷酰胺+五子衍宗方组(高剂量) 0.05+0.84 0.73±0.11##

3.3 对环磷酰胺化疗荷瘤小鼠脾脏指数、脾细胞绝对数量及相对数量的影响 荷瘤小鼠经环磷酰胺治疗后，小鼠脾脏指数减小，小鼠脾脏质量显著减低，脾细胞绝对计数、脾细胞相对计数显著减少;环磷酰胺加五子衍宗方高、低剂量治疗后小鼠脾脏指数降低;环磷酰胺加五子衍宗方高剂量组较环磷酰胺单独治疗小鼠脾脏质量明显降低，脾细胞绝对计数和相对数量明显上升。其中相对计数为每克脾脏组织的淋巴细胞绝对数量。结果见表3。

3.4 对环磷酰胺化疗荷瘤小鼠CD19+细胞的影响 环磷酰胺组CD19+细胞绝对数量与荷瘤对照组相比较其绝对数量锐减;与环磷酰胺单独用药相比较，环磷酰胺加五子衍宗方高、低剂量联合治疗组小鼠脾脏CD19+细胞绝对数量显著上升。结果见表4。

表3 对环磷酰胺化疗荷瘤小鼠脾细胞绝对数量及相对数量的影响(±s，n=10)

表3 对环磷酰胺化疗荷瘤小鼠脾细胞绝对数量及相对数量的影响(±s，n=10)

注:与荷瘤对照组相比，#P＜0.05;##P＜0.01;与环磷酰胺组相比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

组 别 剂量/(g·kg－1) 脾脏质量/g 脾脏指数/(mg·g－1)脾细胞绝对计数/(×107)脾细胞相对计数/(×107·g－1)荷瘤对照组 － 0.21±0.01＊＊ 9.08±0.48*9.49±1.13 45.86±4.45环磷酰胺组 0.05 0.12±0.05## 6.07±0.64# 3.82±0.37## 28.38±0.94#环磷酰胺+五子衍宗方组(低剂量) 0.05+0.42 0.11±0.01## 5.89±1.25# 4.56±0.36# 39.52±2.13#*环磷酰胺+五子衍宗方组(高剂量) 0.05+0.84 0.10±0.01##* 5.03±0.58# 5.36±0.46#* 50.57±10.22#*

表4 对环磷酰胺化疗荷瘤小鼠CD19+细胞绝对数量的影响(±s，n=10)

表4 对环磷酰胺化疗荷瘤小鼠CD19+细胞绝对数量的影响(±s，n=10)

注:与荷瘤对照组相比，##P＜0.01;与环磷酰胺组相比，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01。

组别 剂量/(g·kg－1) CD19+绝对数量(×107)荷瘤对照组1972.78 ±128.69环磷酰胺组 0.05 417.75±223.53##－环磷酰胺+五子衍宗方组(低剂量) 0.05+0.42 421.87 ±55.12#＊＊环磷酰胺+五子衍宗方组(低剂量) 0.05+0.84 1348.83±447.73#*

3.5 对环磷酰胺化疗荷瘤小鼠CD4+CD69+绝对数量、CD4+和CD8+绝对数量及CD4+/CD8+比例的影响 环磷酰胺治疗组小鼠CD4+CD69+绝对数量较荷瘤对照组减少;小鼠CD4+T细胞绝对数量锐减，CD8+T细胞数量上升;CD4+/CD8+比例显著降低;与环磷酰胺单独治疗组相比，环磷酰胺加五子衍宗方高、低剂量组小鼠CD4+CD69+绝对数量亦明显增加;CD4+T和CD8+T细胞绝对数量显著上升;CD4+/CD8+比例亦显著回升。结果见表5。

4 讨论

环磷酰胺是为最常用的烷化剂类抗肿瘤药，在抑制肿瘤细胞生长与繁殖的同时，可导致骨髓抑制、免疫低下、生殖损害等毒副作用［3-4］。我们前期研究发现五子衍宗方对环磷酰胺致免疫低下模型小鼠的免疫功能有明显恢复作用，本研究中，我们联合五子衍宗方和环磷酰胺对H22荷瘤小鼠进行治疗，观察了五子衍宗方对环磷酰胺化疗的减毒作用，并对其免疫学机制进行了初步探讨。

表5 对H22荷瘤小鼠CD4+CD69+绝对数量、CD4+和CD8+绝对数量及CD4+/CD8+比例的影响 (±s，n=10)

表5 对H22荷瘤小鼠CD4+CD69+绝对数量、CD4+和CD8+绝对数量及CD4+/CD8+比例的影响 (±s，n=10)

注:与荷瘤对照组相比，#P＜0.05，##P＜0.01;与环磷酰胺组相比，*P＜0.05。

CD4/CD8荷瘤对照组 － 168.92±13.29 225.86±40.13 61.40±6.61 1.78组别 剂量/(g·kg －1)CD4+CD69+绝对数量(×107)CD4绝对数量(×107)CD8绝对数量(×107)±0.17环磷酰胺组 0.05 49.81±7.16## 104.20 ±9.52## 100.88±18.10# 1.11±0.14#环磷酰胺 +五子衍宗方组(低剂量)0.05+0.42 95.51±8.15##* 150.13 ±13.02#* 119.42±5.82# 1.56±0.11#*环磷酰胺 +五子衍宗方组(高剂量)0.05+0.84 56.24±11.40## 156.62 ±35.07#* 130.41±43.66# 1.96±0.31*#

脾脏是机体最大的外周免疫器官，其免疫细胞种类丰富，因此脾脏指数和淋巴细胞绝对计数往往反映其外周免疫功能的强弱，尤其是脾脏淋巴细胞绝对值能够反映实际免疫状态［5-6］。在本实验中，与环磷酰胺单用组相比，五子衍宗方联合环磷酰胺化疗的小鼠脾脏指数和脾脏淋巴细胞绝对计数明显上升。CD4+/CD8+比例是肿瘤患者机体免疫状态的指标之一，本研究结果发现五子衍宗方联合用药组的CD4+/CD8+比例显著高于环磷酰胺组，提示五子衍宗方能够拮抗环磷酰胺的免疫毒性，能较好恢复荷瘤机体的免疫力，有效改善免疫系统的基础状态，有利于发挥机体自身的抗肿瘤能力。

传统化疗药物往往直接攻击肿瘤细胞，同时损伤正常免疫细胞，如何同时激发机体自身的抗肿瘤免疫反应引起越来越多关注。机体抗肿瘤免疫反应十分复杂，一般以细胞免疫为主，其中CD4+T细胞的激活是发挥抗肿瘤免疫的前提条件之一［7］。CD4+T细胞激活后参与激活B细胞、巨噬细胞、NK细胞，从而发挥协调抗瘤作用和直接杀瘤作用［5］。本实验中我们发现:荷瘤小鼠脾脏保持一定数量的CD4+T细胞数量，经环磷酰胺化疗的小鼠脾脏CD4+T细胞数量明显下降;由于肿瘤抗原刺激，荷瘤小鼠有一定数量的CD4+T细胞表达CD69分子，而在同一时间点激活的CD4+T细胞在环磷酰胺治疗组明显下降，提示环磷酰胺可致荷瘤小鼠自身抗肿瘤免疫反应受到抑制。相反地，五子衍宗方联合环磷酰胺治疗荷瘤小鼠，出现CD4+T细胞数量上升，激活的CD4+CD69+T细胞数量明显增加，提示五子衍宗方能有效促进化疗荷瘤小鼠体内辅助性T细胞的活化并参与肿瘤免疫应答。

B细胞数量锐减为环磷酰胺对免疫系统损害的突出特征［8］。本实验亦发现环磷酰胺可导致荷瘤小鼠B细胞数量锐减。五子衍宗方能够显著增加B细胞数量。提示五子衍宗方能拮抗环磷酰胺对免疫系统的损害，促进机体自身抗肿瘤体液免疫应答，因而抑瘤效果高于单用环磷酰胺。该现象也可能与五子衍宗方同时促进体内辅助性T细胞的大量活化继而增强体液免疫有关，具体机制有待进一步探讨。

本研究提示五子衍宗方能够明显降低环磷酰胺的毒副作用，可通过增强机体自身抗肿瘤免疫效应，从而改善环磷酰胺化疗效果，其具体机制还有待进一步研究。

［1］王洪武，贾亮亮，徐媛青，等.五子衍宗汤对环磷酰胺致免疫低下小鼠的免疫调节作用［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17(4):144-146.

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［4］吕高波，张 澍，李宗芳.门静脉高压症脾脏淋巴细胞数量及增殖功能变化的研究［J］.中华肝胆外科杂志，2008，11(14):770-773.

［5］Zhu J F，Yamane H，Paul W E.Differentiation of effector CD4 T cellpopulations［J］. Annu RevImmunol， 2009， 28:445-489.

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