马 镝，金 星，赵新华，李春红，曹敏建

（沈阳农业大学，辽宁 沈阳 110866）

玉米丝黑穗病是丝轴黑粉菌引起的世界性重要病害，在中国北方春玉米产区发生较为严重[1]。壳寡糖是植物识别病源真菌入侵的非特异性信号，对许多植物显示强烈的诱导活性可激发植物的自身抗性[2]。当玉米受到微生物侵染时，会启动自我防御响应以抵抗病原菌进攻，这种自我防御能力可以由外源性寡糖诱导产生，激活玉米防御酶系活性，提高自身抵抗力。

早期对玉米丝黑穗病的研究主要集中在生物学特性、发生条件、防治方法等方面[3]。近期出现了对玉米丝黑穗病抗性机制的研究，如对根系渗出物、Vc和总糖含量与病菌互作的研究，还有对玉米丝黑穗病菌侵染后的寄主防御酶系活性变化的研究[4]，但对于壳寡糖诱导抗性的研究未见报道。试验研究了壳寡糖种衣剂和化学种衣剂处理的玉米在接种和不接种玉米丝黑穗病菌的状态下，其防御酶系活性的变化。以期为生产上减少化学农药使用量提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料 玉米品种为先玉335。

1.1.2 土 样 采自长白山土壤，共收集25份样品，采集后自然晾干后置于4℃冰箱保存。

1.1.3 培养基 富集培养基：壳聚糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母膏2 g/L，用土壤浸出液配制。

平板分离培养基：壳聚糖5.0 g/L，KH2PO42.2 g/L，Na2HPO4·12H2O 1.0 g/L，（NH4）2SO40.8 g/L，NaNO31.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，CaCl20.01 g/L，KCl 1.5 g/L，蛋白胨 0.5 g/L，酵母膏 0.5 g/L，琼脂15 g/L，pH值6.0，壳聚糖溶液应事先调至pH值6.0，并与其他成分分开灭菌后混和。

斜面培养基：蛋白胨20 g/L，酵母膏10 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂20 g/L，pH值自然。

种子培养基：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母膏 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KCl 1.5 g/L，KH2PO41.9 g/L，Na2HPO4·12H2O 0.9 g/L，Na2SO41.5 g/L，CaCl20.01 g/L，调至pH值6.5。

复筛摇瓶培养基：平板分离培养基中不加琼脂，另外加入葡萄糖5 g/L，其他相同。

1.2 仪器

日本岛津紫外-可见分光光度计（UV-12002）；H1TACHI低温离心机（CR21G）。

1.3 土壤产壳聚糖酶菌株的筛选

1.3.1 富集培养 取各个土样各约9 g，置于加有100 mL无菌水和玻璃珠的三角瓶中，30℃振荡（180 r/min）30 min，使样品充分打散后，放置沉淀，取上清液5 mL，加入到事先灭过菌的富集培养基中，28℃摇瓶富集培养3 d。

1.3.2 菌株分离 以壳聚糖为唯一碳源，用稀释平板法分离富集后的样品。于30℃培养箱中培养4～5 d，然后选择在培养基上形成的透明圈直径与菌落直径的比值较大的菌落进一步进行复筛。

1.3.3 菌种纯化 将菌株分离后得到的斜面培养基内的菌株接入种子培养基中30℃振荡（120 r/min）培养2 d后，用接种环取少量菌株样品接入平板固体培养基，采用平皿划线分离法对菌株进行纯化，于30℃培养2～6 d后得到的单菌落接入斜面培养基。

1.3.4 透明圈法筛选 将菌种纯化得到的斜面培养基内纯化好的菌株用灭菌后的牙签点接种于平板分离培养基上，于30℃培养2～3 d，将菌落周围透明圈稍大者挑出，接入斜面培养基。于30℃培养2～3 d，观察产生的透明圈。

1.3.5 复筛摇瓶培养法筛选 将透明圈法筛选得到的斜面培养基内菌株接入种子培养基中，30℃振荡（120 r/min）培养2 d后，取8%接种量接入菌种筛选摇瓶培养基，30℃振荡（120 r/min）培养，不同时间检测酶活力。

1.4 壳寡糖的制备

取30.0mL 1.0%的胶体壳聚糖，加入30.0mL pH值5.0乙酸缓冲液稀释的30.0 mL巨大芽孢杆菌BS-506发酵酶液，55℃反应2 h后，沸水浴10 min终止反应，加入0.25mol/L NaOH 10.0mL，使未完全反应的壳聚糖沉淀，离心，去除沉淀，上清液经冷冻干燥制成粉末，配成2%的壳寡糖溶液。

1.5 试验设计

试验共设4个处理：处理1为15%立克秀，处理2为30%顶苗新，处理3为2%壳寡糖，处理4为空白对照（CK）。各处理均分为接种和不接种玉米丝黑穗病菌两种方式，3次重复，总计24个小区。每个小区播两行，每埯2粒，株距0.25 m，行距0.6 m，行长6 m，每小区面积为7.2 m2，试验区总面积为172.8m2。

1.6 种植方法

将每种药液按定量慢慢沿烧杯壁加入大烧杯内，并将称取的50倍药液重量的种子加入烧杯，用手握住烧杯顺时针方向甩转，直至药液与种子充分混合均匀，杯壁内侧干净无药为止，使药液均匀地附着在种子表面，拌好的种子晾干。

2011年5月12日播种，采用垄上埯播，播种时，按0.1%加入丝黑穗病菌粉与菌土充分混匀，开穴后先放种子，然后每埯盖菌土100 g。

1.7 粗酶液的提取

分别取8种处理的玉米品种先玉335第3叶，去叶脉后，各称取1 g，－20℃冰箱保存，待测。同时，配置0.2mol/L pH值8.8的硼酸缓冲液500mL。取出冰箱中的样品，放入预冷的研钵中，加入1.5 mL硼酸缓冲液，冰浴中充分研磨后，转移至预冷的离心管，用1.5mL上述缓冲液冲洗，合并倒入预冷的5mL 离心管中，10 000 r/min，4℃离心 20min，上清液即为酶粗提取液。将酶粗提取液迅速倒出，放入－20℃冰箱中保存待用。

1.8 玉米防御酶系活性测定

过氧化物酶（POD）活性测定参照李合生等[5]方法。超氧化物歧化酶（SOD）活性测定参照Giannoplitis和Ries[6]及刘鸿先等[7]的方法。多酚氧化酶（PPO）活性测定参照李靖[8]方法。苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性测定参照Koukol和Cornn[9]方法。

2 结果与分析

2.1 产壳聚糖酶菌株筛选结果

在富集培养基中，以壳聚糖为唯一碳源，通过对各个土样的富集培养，能利用壳聚糖的微生物大大增加，而不能利用的则大部分被淘汰。采用透明圈法，在以壳聚糖为唯一碳源的平板上筛选分离得到了9株产壳聚糖酶菌株。经菌落观察和镜检，大部分为霉菌，少数是细菌和酵母菌。在培养过程中，挑选菌落生长良好，透明圈明显的菌落继续培养，产生的透明圈不断增大。

图1 SH-0109菌株产生的透明圈

选择透明圈直径和菌落直径比值（D/d）较大的9个菌落为出发菌株，进一步进行摇瓶发酵，48 h后测定发酵液的壳聚糖酶酶活，结果表明SH-0109为产壳聚糖酶最好的菌株，菌落直径为4.0mm，透明圈直径30.0mm，透明圈直径与菌落直径的比值为7.5，酶活力为0.55 U/mL。

2.2 种衣剂对玉米叶片POD活性的影响

过氧化物酶（POD）在植物机体防御体系中起重要作用，不仅参与了木质素的聚合过程，也是细胞内重要的内源活性氧清除剂，结果表明（图2），无论在接种区还是非接种区，壳寡糖种衣剂都能提高POD酶活性。使用壳寡糖，POD酶活在接种区达28.02 U/mg，非接种区达27.57 U/mg，均比对照的POD酶活高。壳寡糖种衣剂可提高POD的活性。因此，可以通过壳寡糖部分取代化学农药，提高植物体过氧化物酶的活性。

图2 种衣剂对玉米POD活性影响

2.3 种衣剂对玉米叶片SOD活性的影响

SOD是一种活性氧清除酶类，是植物细胞内防御酶系统的重要成员之一。使用壳寡糖种衣剂，SOD酶活在接种区达156.72 U/mg，非接种区达150.19 U/mg，均比对照（处理4）的SOD酶活高。试验结果表明（图3），无论在接种区还是非接种区，均表现为壳寡糖种衣剂对SOD酶活提高幅度更大。因此，可以通过壳寡糖部分取代化学农药，提高植物体自身的防御酶活。

图3 种衣剂对玉米SOD活性影响

2.4 种衣剂对玉米叶片PPO活性的影响

PPO是一种抗病反应次生代谢酶类，主要参与酚类氧化为醌以及木质素前体的聚合作用，与植物抗病密切相关。结果表明（图4），无论在接种区还是非接种区，均表现为壳寡糖种衣剂对PPO酶活提高幅度更大。使用壳寡糖种衣剂，PPO酶活在接种区达456.72 U/mg，非接种区达440.19 U/mg，均比对照的PPO酶活高。壳寡糖种衣剂可提高PPO的活性。因此，可以通过壳寡糖部分取代化学农药，提高植物体自身的防御酶活，减低化学农药对环境的污染。

图4 种衣剂对玉米PPO活性影响

2.5 种衣剂对玉米叶片PAL活性的影响

PAL是植物苯丙烷类次生代谢途径总路第一步关键酶，是苯丙烷类代谢途径的关键酶和限速酶，它催化苯丙氨酸脱氨基后产生肉桂酸并最终转化为木质素，因此它是与细胞内木质素生成和沉积有关的防御酶。使用壳寡糖种衣剂，PAL酶活在接种区达308.72 U/mg，非接种区达303.19 U/mg，均比对照（处理4）的PAL酶活高。壳寡糖种衣剂可提高PAL的活性。结果表明（图5），在接种区和非接种区均表现为壳寡糖种衣剂对PAL酶活提高幅度更大。

图5 种衣剂对玉米PAL活性影响

3 结论与讨论

植物的抗病性一般包括植物细胞内活性氧的积累与清除、抗病信号的产生与转导、防卫反应的表达与调控等。在这一复杂过程中，一些酶类起着很重要的调控作用，相关酶类包括活性氧清除酶类和抗病反应次生代谢酶类。宋瑞芳等[10]研究认为POD是催化脂肪族、芳香族和酚类化合物氧化及木质素合成的关键酶之一。PAL是植物抗性物质生成途径莽草酸途径中酚类物质、植保素、木质素等抗菌物质合成过程中最关键的酶类。PAL是诱导酶，是植物抗病代谢（莽草酸途径）的关键酶和定速酶，POD不仅参与木质素的聚合反应，而且是细胞内重要的内源活性氧清除剂，PPO是酚类物质氧化的主要酶，酚类物质氧化产生醌类或参与木质素的合成，以杀死或抑制病原菌的繁殖而起到抗病作用，SOD能消除超氧自由基而对细胞具有保护作用。

壳寡糖种衣剂作为生物农药在玉米上的报道较少，关于其诱导玉米自身抗性的研究还未见报道。该研究为进一步探讨其诱导抗性机制提供了依据。研究结果表明，经由立克秀或定苗新处理后4种酶活性均较对照稍低，表明化学农药对玉米的防御酶系活力有一定伤害；而壳寡糖处理玉米种子之后，植株的防御酶系（PAL、POD、PPO、SOD）活性普遍升高，表明壳寡糖能够诱导植物的信号系统，启动植株体内防御酶系的表达。壳寡糖通过调整植物抗病基因的活化，使玉米产生对玉米丝黑穗病的抗性，并非直接作用于病原菌的抑菌反应。因此，在病原菌侵入前进行壳寡糖种子处理，才能达到防病的效果。

[1] 张小飞，高增贵，庄敬华，等.玉米丝黑穗病菌致病性分化研究[J].玉米科学，2010，18（2）：100-103.

[2] 赵龙杰，徐翠莲，韩富根，等.壳寡糖席夫碱对烟草花叶病毒的诱导抗性[J].江苏农业科学，2011，39（5）：131-133.

[3] 时俊光，王作英，陈晓旭.几种玉米种衣剂对玉米丝黑穗防治效果筛选试验研究[J].杂粮作物，2010，30（2）：136-137.

[4] 贺字典，高增贵，庄敬华，等.玉米丝黑穗病菌对寄主防御相关酶活性的影响[J].玉米科学，2006，14（2）：150-151，155.

[5] 李合生.植物生理生化实验原理和技术[M].北京：高等教育出版社，2000.164-165.

[6] Giannoplitis C N,Ries S K.Superoxide dismutase:I.Occurrence in higher plants[J].Plant Physiol,1997,59:309-314.

[7] 刘鸿先，曾韶西，王以柔.低温对不同耐寒力的黄瓜子叶各细胞器中超氧物歧化酶的影响[J].植物生理学报，1985，（11）：46-57.

[8] 李 靖，利容千，袁文净.黄瓜感染霜霉病菌叶片中一些酶活性的变化[J].植物病理学报，1991，12（4）：227-283.

[9] Koukol J,Cornn E E.Themetabolism of aromatic compounds in higher plants IV. Purification and propcities of the phenylalanine-deaminase of Herdeum vulagare[J].Journal of Biological Chemistry,l961,23:2692-2698.

[10] 宋瑞芳，丁永乐.烟草抗病性与防御酶活性间的关系研究进展[J].中国农学通报，2007，23（5）：309-314.