嘧肽酶素的高效液相色谱分析方法研究

2012-06-08杨仁斌蒋诗琪卢静宜

湖南农业科学 2012年19期

魏凤，杨仁斌，蒋波，傅强，蒋诗琪，卢静宜

（湖南农业大学农业环境保护研究所，湖南长沙 410128）

嘧肽霉素是由不吸水链霉菌（Streptomyces achygroscopicus）产生的一种新型的抗病毒农用抗生素，对番茄病毒病、烟草花叶病毒病、辣椒病毒病、瓜类病毒病和玉米矮花叶病毒病等均有显著防效[1-2]。目前，对嘧肽酶素的研究主要集中在生产、抗病机理及其抗生组份等方面，而对嘧肽酶素分析检测方法的报道较少。笔者采用高效液相色谱法对嘧肽酶素进行检测分析，探讨了嘧肽酶素的色谱检测条件。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验仪器 LC-20AT型高效液相色谱仪（带紫外检测器及LC solution工作站，日本岛津公司）；紫外分光光度计（岛津UV-2450）；玻璃仪器气流烘干器（KQ-C，巩义市英峪予华仪器厂）；超声波清洗器（KQ-100 E，昆山市超声仪器有限公司）；万分之一天平（岛津AUY 220）；电子天平（上海光正医疗仪器有限公司）。

1.1.2 主要试剂 99.0%的嘧肽酶素标准品和4.0%的嘧肽酶素试样（农业部农药检定所）；甲醇（色谱纯）。

1.2 试验方法

1.2.1 标液和试样的配制标液：准确称取0.025 0 g嘧肽酶素标准品于50mL棕色容量瓶中，用20%甲醇溶液（甲醇∶水=20∶80，V∶V）溶解并稀释至刻度。试样：准确称取0.025 0 g嘧肽酶素试样于50mL棕色容量瓶中，用20%甲醇溶液溶解并稀释至刻度，用0.45μm滤膜过滤，滤液备用。

1.2.2 色谱条件 Inertsil ODS-SP色谱柱（5μm，4.6 mm×250 mm）；进样量 20 μL。对检测波长、流动相配比、流速及柱温4个条件进行优化：在190～350 nm的波长范围内进行扫描，选择最适检测波长；流动相为甲醇-水溶液，体积比：1∶99、4∶96、7 ∶93、10 ∶90；流速：1.0 mL/min、0.9 mL/min、0.8 mL/min、0.7mL/min、0.6mL/min）；柱温：25℃、30℃、35℃。

1.2.3 测定在最适色谱条件下，待仪器基线基本稳定后，连续注入数针标样溶液，计算各次响应值的重复性，待相邻2次的响应值变化小于1%，按照标样溶液、试样溶液、试样溶液、标样溶液的顺序进行测定[3]。

试样嘧肽酶素质量分数 X1（%）=A2·m1·P/A1·m2；式中：A1为标样溶液中嘧肽酶素的峰面积平均值，A2为试样溶液中嘧肽酶素的峰面积平均值，m1为标样的质量（g），m2为试样的质量（g），P 为标样中嘧肽酶素的质量分数（%）。

1.2.4 线性关系检验准确称取嘧肽酶素标准品，用甲醇-水溶液逐级稀释，配置成一系类质量浓度为 0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2mg/L 的工作液；在最适色谱条件下，分别进行测定，绘制标准曲线。

1.2.5 稳定性和准确度的检验在最适色谱条件下，对同一待测样品重复测定6次，以检验分析方法的稳定性；准确称取5份含有嘧肽酶素的平行试样，分别加入等量的嘧肽酶素标样，在最适色谱条件下，测定其添加回收率，以检验分析方法的准确度。

2 结果与分析

2.1 检测波长的选择

将质量浓度为1 mg/L的嘧肽酶素标准溶液在190～350 nm的波长范围内进行扫描（图1），结果表明在250 nm及279 nm处的吸收值相对较大，但在279 nm处样品中杂质干扰较为强烈，故确定250 nm为检测波长。

图1 嘧肽酶素紫外波长扫描

2.2 流动相、柱温和柱流量的选择

在高效液相色谱操作条件下，用峰面积进行定量，其保留时间和分离效果进行定性[4]，结果表明：当甲醇-水体积比为4∶96，柱温为30℃，柱流量为0.7 mL/min时，对嘧肽酶素的分离效果最好，峰形最好，保留时间相对适宜（图2）。这表明甲醇-水体积比4∶96，柱温30℃，柱流量0.7 mL/min为最适色谱条件。

2.3 线性关系

图2 最适色谱条件下嘧肽酶素的检测峰

以工作液质量浓度为横坐标、测得的相应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线图，得到的线性方程为y=46 618 x+427.84，r=0.999 9，线性关系良好。

2.4 分析方法的稳定性和准确度

在最适色谱条件下，对同一待测样品进行6次重复测定，检测结果分别为4.01%、3.99%、4.00%、4.01%、3.98%、4.00%，其标准偏差为 0.19，变异系数为0.20%。这表明该色谱条件下样品的检测较稳定，精密度较高。准确度试验结果（表1）表明：嘧肽酶素的添加回收率均在97.40%以上，平均添加回收率达98.81%，这表明该分析方法准确度较高。