陈靓靓，罗为桂，刘 清，苏 益

（湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128）

植物 HKT（high-affinity K+transporter）是一类Na+（或K+）转运体或Na+-K+共转运体的总称，与植物Na+的吸收、转运及耐盐关系密切[1-3]。HKT与微生物的Trk/Ktr同源，它们共同组成了Trk/Ktr/HKT基因家族[4-5]。TaHKT1首先从小麦（Triticum aestivum L.）中分离[6]，随后在拟南芥（Arabidopsis thaliana L.）、水稻（Oryza sativa L.）等植物中也发现了 HKT基因[7-8]。HKT由多个跨膜区和多个孔环（pore loop，P-loop）组成，基本结构单元是MPM（Transmembrane segment,Pore,Transmembrane segment），植物HKT通常含有4个MPM结构。第1个P-loop中关键的氨基酸位点Gly/Ser影响离子渗透性[9]。HKT家族成员数量巨大，功能较复杂，到目前为止，对高等植物HKT的研究主要集中在拟南芥、水稻和小麦等少数物种中且涉及的成员较少，还未见研究玉米（Zeamay L.）HKT的相关报道。该研究利用各种生物信息学分析工具，将1个玉米中功能还未知的HKT蛋白序列（NP_001168576.1）初步命名为ZmHKT1；5，并分析其蛋白氨基酸序列，推测ZmHKT1；5蛋白的进化位置、理化性质及分子结构，旨在为进一步试验研究ZmHKT1；5转运体在玉米中的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

以GenBank中检索到的1个玉米中功能还未知的HKT蛋白序列（NP_001168576.1）为检索序列，使用Blastp程序检索蛋白质序列数据库，筛选获得同源HKT转运体。

1.2 方法

1.2.1 分子进化分析 采用ClustalX1.83[10-11]软件进行多重序列比对，将ClustalX比对结果导入PHYLIP3.69软件包，用bootstrap程序生成随机样本，随机样本导入prodist程序计算距离矩阵，neighbor程序将距离矩阵转换为N-J多重树，使用consense程序汇总所得多重树得到严格一致树，最后将进化树文件导入MEGA5.05绘制进化树。

1.2.2 蛋白质性质与结构分析 采用ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）分析蛋白质理化性质；以BioEdit7.01程序中Hphob./Kyte&Doolittle标度进行疏水性分析；以SignalP4.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）进行信号肽预测；以SOSUI（http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/）进行跨膜区域预测；以 PredictProtein（http://www.predictprotein.org/）进行二级结构预测；以Phyre2（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/htm l/page.cgi?id=index）进行三级结构预测。

2 结果与分析

2.1 ZmHKT1；5分子进化分析

2.1.1 多重序列比对 根据第1个P-loop过滤器（filter）上关键氨基酸位点的不同可将植物HKTs分成两个亚家族[4]。亚类I：第1个P-Loop中关键位点为丝氨酸，通常情况下这类HKT对Na+具有特异选择性，所有单子叶和双子叶植物中都含有该类转运体[2，12]。亚类II：第1个P-loop中关键位点为甘氨酸，这类转运体具有K+-Na+共转运特性[8-9]，该亚家族成员只出现在单子叶植物中，但是水稻OsHKT2；1依然为丝氨酸特性[13]。已有研究表明，HKT家族转运体在植物耐盐和调节体内的Na+/K+平衡中发挥了重要作用[14-15]。利用ClustalX1.83软件进行多重序列比对，截取HKT类蛋白的4个P-loop区中高度保守的特征性的氨基酸位点多为甘氨酸（G），ZmHKT1；5蛋白第 1个 P-loop中含有丝氨酸，属于亚家族I。

2.1.2 蛋白质分子进化分析 进化树分析及聚类结果如图1所示，在HKT蛋白家族中与ZmHKT1；5 关系较近的转运体有 OsHKT1；5、HvHKT1；5、TaHKT1；5等，预示着在功能上ZmHKT1；5蛋白可能与这些蛋白最为接近，因此将该HKT归为亚家族I并命名为ZmHKT1；5是合理的。

2.2 ZmHKT1；5性质与结构分析预测

图1 ZmHKT1;5蛋白及其同源蛋白的进化树分析

2.2.1 理化性质 ZmHKT1；5蛋白由467个氨基酸残基组成，分子量为50.88 kD，等电点为9.06。含量较高的氨基酸残基是Leu（58个）、Ser（47个）、Val（44个）、Ala（39个）、Gly（35个），酸性氨基酸残基总数（Asp+Glu）为30，碱性氨基酸残基总数（Arg+Lys）为38。蛋白分子中含有9个半胱氨酸，假设全部形成二硫键时，280 nm处的摩尔消光系数为 50 920 L/(mol·cm)，0.1% 浓度（1 g/L）的吸光值为1.001。假设蛋白分子中形成的二硫键全部打开，280 nm处的摩尔消光系数为50 420 L/(mol·cm)，0.1%浓度（1g/L）的吸光值为0.991。成熟蛋白质在溶液中的不稳定指数为40.73，高于阈值40，性质不稳定。脂肪族指数为98.31，总平均亲水性为0.331，疏水性较强。

2.2.2 疏水性分析 根据BioEdit分析结果可知，整个ZmHKT1；5蛋白中疏水性最大值约为3.09，最小值约为-2.89，疏水性强的区域按疏水程度从大到小依次为：360～380、250～265、300～325、390～405、45～65、175～200、145～160、125～135、20～35、280～290、440～450、225～235，这些区域可能是蛋白质的结构域（图2）。

图2 ZmHKT1；5蛋白疏水性分析

2.2.3 信号肽预测 使用在线信号肽预测程序SignalP4.0预测ZmHKT1；5蛋白N端序列，由图3可知，各值均未超过阈值，ZmHKT1；5不具信号肽。

图3 ZmHKT1；5信号肽分析

2.2.4 跨膜区域预测 使用在线工具SOSUI分析ZmHKT1；5的膜结构，由表1可知ZmHKT1；5为典型膜蛋白，具有8个跨膜结构。ZmHKT1；5可能的跨膜结构模型如图4所示。

图4 ZmHKT1;5蛋白跨膜结构模型

2.2.5 二级结构预测 PredictProtein的预测结果表明，ZmHKT1；5含有58.67% α 螺旋（H）、7.07% β折叠（E）和34.26%无规卷曲（L）。

2.2.6 三级结构预测 用Phyre2检索分析ZmHKT1;5序列，以折叠识别法进行三级结构预测。Phyre2在 PDB（Protein Data Bank）数据库中检索到编号为c3pjzA的模板（副溶血性弧菌钾转运体TrkH的晶体结构）与目标蛋白有很好的同源性，能以100%的信度为目标蛋白80%的序列构建三级结构。如图5所示，ZmHKT1；5蛋白的三级结构根据氨基酸顺序着色，顺着蛋白N端到C端着色由浅变深，与二级结构预测及跨膜结构预测结果比照，结果较为统一，所得三级结构预测较为可信。

图5 ZmHKT1；5蛋白三级结构预测

3 讨论

通过生物信息学手段分析了玉米中新型HKT家族蛋白ZmHKT1；5的蛋白序列，确定了该蛋白分类和进化位置。ZmHKT1；5具有在氨基酸序列上丝氨酸特性，可能是1个Na+选择型的转运体。从该各项理化性质看，ZmHKT1；5具有较强的疏水性。从二级结构上，ZmHKT1；5含大量α螺旋，也含有较多的无规卷曲，β折叠的含量较少，这种组成与该蛋白的跨膜结构域的形成密切相关，为该蛋白的离子转运功能的实现提供基本结构基础。ZmHKT1；5为典型的膜蛋白，具有8个跨膜螺旋，形成4个MPM结构，各个跨膜结构的具体生理功能还有待进一步探索。已有研究表明，与ZmHKT1；5亲缘关系很近的OsHKT1；5和TaHKT1；5为Na+选择型转运体，能从根木质部卸载Na+，通过控制根木质部Na+的移动来调节水稻中K+/Na+的比率，维持根中高的K+浓度和低的Na+，在植物耐盐中起了重要作用[16]。另外，根据ZmHKT1；5的三维构象及其与其他HKT类蛋白高度的同源性可以推测，ZmHKT1；5蛋白可能在玉米的Na+吸收、转运与调控Na+/K+平衡等方面具有重要作用，其生理功能及其结构与功能的关系还有待进一步深入研究。

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