马立民 段明科 郭雷 王涛 郑鸿翱

近年来，随着体外循环的广泛开展以及肺移植的逐渐成熟，肺缺血-再灌注(ischemia reperfusion，IR)损伤越来越受到重视。本实验通过建立大鼠在体的肺IR模型，研究蛋白酶抑制剂:U对肺IR损伤中炎症反应中的细胞因子IL-10以及sICAM-1的作用，同时应用同位素方法验证肺组织通透性的变化。

1 材料与方法

1.1 一般材料 成年健康SD大鼠60只，雄性，体重280～320 g，由汕头大学医学院实验动物中心提供;乌司他丁(Ulinastatin，U)注射液由广东天普生化医药股份有限公司提供;白细胞介素-10(IL-10)和可溶性细胞黏附分子-1(sICAM-1)试剂盒购自美国R＆D Systems公司(酶联免疫吸附法试剂盒);考马斯蛋白测定试剂盒购自美国PIERCR公司;125I同位素源购自中国同位素公司。

1.2 模型制备 3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔内注射麻醉，麻醉成功后每只大鼠肌内注射阿托品0.04 mg/kg，气管切开后插管连接小动物呼吸机控制呼吸，呼吸频率60次/min，吸呼比1∶1.5，工作压力(即潮气量):0.02 mPa，吸氧浓度(FiO2)1.0。经左胸第5肋间进入胸腔，游离左侧肺门，由肺门下方绕过阻断带备阻断，阻断前5 min每只大鼠由阴茎背静脉注射肝素50 U(生理盐水稀释，每只0.5 ml)。

1.3 动物分组 36只SD大鼠随机分为6组(每组6只):假手术组(S组):完成以上手术操作，但肺门不阻断;缺血0.5 h组(Ⅰ组):阻断肺门后造成肺缺血30 min;缺血-再灌注组(IR组)，又分为两个时段:缺血30 min，再灌注30 min组(IR30)和再灌注120 min组(IR120);乌司他丁组，亦分为两个时段:缺血30 min后，再灌注30 min组(U30)和再灌注120 min组(U120)。乌司他丁组在再灌注前5 min由阴茎背静脉缓慢注射乌司他丁75000 U/kg，IR组注射同等剂量的生理盐水。在再灌注期间，每隔1 h由皮下注射生理盐水0.5 ml以补充水分丢失。试验结束后在各时点用放血法处死动物，取相同部位部分新鲜左肺组织用4%多聚甲醛固定，作常规光镜检查，其余肺组织放入-70℃冰箱待测。

1.4 观察指标 及其检测用ELISA方法分别检测肺组织中IL-10和血浆sICAM-1的含量。采用考马斯亮蓝蛋白测定法检测肺组织中的蛋白含量。

1.5 统计学处理 数据用SPSS 11.0版统计软件进行单因素方差分析(ANOVA)，组间比较采用q检验。

2 结果

2.1 肺组织IL-10水平的变化 正常情况下肺组织中IL-10有少量表达，单纯缺血30 min后IL-10水平即有升高，与S组相比差异有统计学意义(P＜0.01)，再灌注后各时段亦有升高。应用U后各时段和IR组相应时段相比IL-10水平显著高于S组(P＜0.01)。见表1。

2.2 血浆sICAM-1水平的变化 缺血30 min后sICAM-1水平虽然有所升高，但和S组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。再灌注30和120 min后sICAM-1明显升高，和S组及Ⅰ组相比均差异有统计学意义(P＜0.01)，应用U后各时段sICAM-1水平明显低于IR组(P＜0.01)。见表1。

表1 各组大鼠IL-10、sICAM-1水平的变化

2.3 肺组织通透性的变化(125IBSA漏出量表示，单位:counts.min-1 g tissue/ml blood)缺血30 min后肺组织通透性有所升高(0.085±0.014)，和S组相比差异有统计学意义(P＜0.05)，IR30 min(0.164±0.018)和 120 min(0.227±0.024)和S组和Ⅰ组相比均差异有统计学意义(P＜0.01)，而U组各时段(0.092±0.015，0.104±0.009)和IR组各时段相比明显降低(P＜0.01)。见图1。

图1 肺组织中125IBSA漏出量的变化

3 讨论

乌司他丁是从人类新鲜尿液中分离纯化出来的一种糖蛋白，是一种蛋白酶抑制剂。近年来研究显示:U不但能够抑制多种蛋白酶及糖和脂类的多种水解酶活性，而且还可以抑制心肌抑制因子的产生、改善休克时的微循环状态、抑制炎症介质的过度释放以及清除氧自由基等多种特殊的药理作用［1］。大量的动物和临床研究均证实了IR过程中的炎症反应是造成肺再灌注损伤的重要机制之一，与肺IR损伤有关的炎症反应过程包括炎症细胞的趋化、浸润、激活以及炎症因子的合成和释放。因此，拮抗炎症反应的损伤性因素，应用各种策略重建体内致炎与抗炎机制的平衡成为减轻IRI的重要措施［2］。

IL-10作为人体内自然产生的抗炎介质，一方面抑制炎性细胞的黏附、浸润，另一方面抑制各种促炎性细胞因子的合成与释放，重建体内炎症介质及抗炎介质的平衡。研究证明在肺IR损伤中，无论是内源性还是外源性的IL-10都可以减轻再灌注损伤，改善肺功能，发挥保护作用［3］。本实验中正常肺组织中IL-10几乎无表达，在缺血阶段IL-10就有上升，表明体内的抗炎机制在缺血期就已经启动，再灌注后随着肺内的炎性改变的增强，IL-10水平亦相应升高，并随着再灌注时间的延长而增加，体现出机体本身对于IR致炎反应的负调节。应用U后IL-10的表达和再灌注组比明显增强，表明UTI可以促进内源性的IL-10的产生，从而可能起到抑制炎症反应，减轻肺组织IR损伤。

sICAM-1存在于人的血清中，是除了位于细胞膜表面的mICAM-1以外的另一种形式。正常状况下，血液中含量极低，但在炎症反应时可被 TNF-α、IL-1、LPS等诱导而大量表达，在介导PMN活化与信号转导中具有重要作用［4］。研究报道，sICAM-1可以活化肺泡巨噬细胞，诱导中性粒细胞的黏附和聚集而产生肺损伤［5］。sICAM-1可通过与CD18相互作用，激发损伤局部的PMN释放弹性蛋白酶，造成远处器官功能失调和损伤。急性肺损伤时，肺泡灌洗液中的sICAM-1的浓度明显升高且和肺损伤的程度呈正相关［6］。血中sICAM-1浓度升高可由于激活的内皮细胞表面表达ICAM-1增多或继发于内皮细胞损伤的蛋白酶溶解作用，故sICAM-1浓度的升高可以作为内皮细胞损伤或激活的标志。单纯缺血30 min肺组织sICAM-1的表达和对照组相比无明显差异，再灌注后表达明显增加，再灌注0.5 h和2 h和S组及Ⅰ组相比均有明显的升高，说明IR可以明显的增加sICAM-1，进一步促进PMN的聚集、激活等炎症级联反应，引起局部及远隔器官的损伤。应用UTI后各时段和再灌注相比sICAM-1水平显著降低，表明UTI不仅可以抑制早期的sICAM-1蛋白质前体的活化，而且可以从基因水平抑制其mRNA的表达，从而起到抑制sICAM-1的致炎作用，减轻肺组织的再灌注损伤。

综上，U通过促进内源性IL-10的表达，抑制sICAM-1的释放而起到抑制肺IR损伤中炎症反应的作用，降低肺组织的通透性，减轻肺组织水肿和肺泡水肿。在临床体外循环或肺移植中适当应用U，可能有益于控制肺IR中的炎症放大作用，避免或减轻肺IR损伤。

［1］ 黄文彬，申捷，张琳，等.乌司他丁对鼠急性肺损伤的保护作用及相关因子的表达.中华急诊医学杂志，2010，19(1):37-42.

［2］ Calixto JB，Campos MM，Otuki MF，et al.Anti-inflammatory compounds of plant origin.Part II.Modulation of pro-inflammatory cytokines，chemokines and adhesion molecules.Planta Med，2004，70(2):93-103.

［3］ 任大宾，孙仁宇.白介素10的抗炎功能及其分子机制.国外医学呼吸系统分册.2005，25(3):175-178.

［4］ Witkowska1 AM，Borawska MH.Soluble intercellular adhesion molecule-1(sICAM-1):an overview.Eur Cytokine Netw.2004，15(2):91-98.

［5］ Kanayama S，Yamada Y，Onogi A，et al.Molecular structure and function analysis of bikunin on down-regulation of tumor necrosis factor-alpha expression in activated neutrophils.Cytokine，2008，42(2):191-197.

［6］ Mendez MP，Morris SB，Wilcoxen S，et al.Shedding of soluble ICAM-1 into the alveolar space in murine models of acute lung injury.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2006，290(5):L962-970.