陈永秀综述，蒙开喜审校

(广西横县人民医院检验科，广西 横县 530300)

地中海贫血(thalassemias) 是一类以珠蛋白α链或β 链合成不足或缺失为特征的隐性遗传性疾病。最常见为α-地中海贫血(α-地贫)和β-地中海贫血(β-地贫)，在我国主要分布在南方，如广东、广西、海南、香港有着较高的发病率[1]。开展地贫检测是临床上诊断贫血类型必不可少的项目，进行血红蛋白电泳及基因检测可以诊断是否是地贫及地贫的类型。区分贫血类型有利对临床贫血的治疗，避免过分补充铁剂造成地贫患者的损害。产前筛查与产前诊断可避免重型地贫患儿的出生[2]，对优生具有重要意义。目前检测地中海贫血的实验室方法主要有筛查法和基因诊断法两种。

1 检测地中海贫血方法(筛查法)

1.1 血常规测定 地中海贫血的重要典型特征之一是小细胞，低色素，最重要的血液学指标为MCV<80fl,MCH<27pg，则可能为地中海贫血(或其基因携带者)或缺铁性贫血。利用MCV、MCH 作为地中海贫血的一种初筛手段具有重要的实用价值[3]。

1.2 红细胞形态学检查 涂片、瑞氏染色，由于贫血轻重不一，红细胞可出现大小不均、多种异常形态、嗜碱性点彩红细胞、靶形红细胞等。贫血越严重，异形性越明显。

1.3 红细胞渗透脆性试验(一管法) 地中海贫血的红细胞膜存在形态、生化、代谢异常，故地中海贫血患者的红细胞脆性降低[4]，在0.36%NaCl 中溶解度降低(脆性降低)。缺铁性贫血亦呈阳性。近几年来国内外普遍采用MCV和红细胞透脆性试验作为地贫诊断的筛查检测项目[5]。

1.4 不稳定血红蛋白测定

1.4.1 异丙醇试验 地中海贫血血液中存在不稳定血红蛋白，不稳定血红蛋白在370C的17%异丙醇溶液中在5min 出现沉淀，20min 左右形成絮状。

1.4.2 热变性试验 不稳定血红蛋白在加温时比正常血红蛋白更容易发生沉淀。在500C～600C 时α-地中海贫血的沉淀量偏高。此法敏感性不高，容易受比色影响，而特异性比异丙醇试验高。

1.4.3 变性血红蛋白包涵体检查 将含有不稳定血红蛋白的红细胞在体外与煌焦油蓝等试剂370C 孵育1h 及2h 后便生成大量包涵体。α-地中海贫血HbH 病的红细胞内含有较多包涵体，变性血红蛋白包涵体是诊断HbH 病的一项简易、方便的方法，同时对α-地中海贫血1和α-地中海贫血2的诊断也有重要意义。

1.5 血红蛋白电泳 血红蛋白电泳是检测和识别异常血红蛋白最常用的实验室方法[6]。

1.5.1 血红蛋白醋酸纤维薄膜电泳 各种血红蛋白均带有电荷，其等电点均在7 以下，故在pH8.5的缓冲液中各种血红蛋白均带负电荷，在电场的作用下都向阳极泳动，不同的血红蛋白，其等电点不同，电泳速度不一，故在电泳图谱上呈现不同位置区带。还可以比较各区带染色强度，换算出HbF、HbA2等的含量，对血红蛋白病的筛查有重要价值。但是，有些异常血红蛋白总的电荷改变极少或不改变，特别是某些不稳定的血红蛋白及氧亲和力增强的异常血红蛋白，电泳时它们不能和HbA 分离而不被检出。因而进一步用多种不同的电泳和用不同的支持介质、缓冲剂、电泳仪器及各种方法。醋酸纤维薄膜较脆，容易破碎，区带颜色容易脱，不易保存。应用大样醋酸纤维薄膜电泳可将各种血红蛋白区带成分分离，洗脱测定各组分的含量。进行区带鉴别与含量的测定，对地中海贫血的诊断起到关键的作用。常用醋酸纤维薄膜pH8.5的缓冲液中进行不连续电泳，将HbA2分离、然后分别剪取HbA2、HbA 区带，用蒸馏水浸泡，用比色计比色，计算出HbA2含量。测定HbA2含量对于地贫的诊断有重要意义[7]。有HbH、Hb Bart’s 区带时剪取HbH、Hb Bart’s 区带，测定HbH、Hb Bart’s含量。

1.5.2 珠蛋白肽链聚丙烯酰胺凝胶电泳 用尿素将血红蛋白解离成多肽链，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳的电荷与分子筛效应，将各种肽链分离，形成不同的区带，当各种珠蛋白链的合量或结构发生异常时，珠蛋白链区带出现与正常不同的改变，通过各区带含量比例的测定了解各珠蛋白基因的表达，可检出β0-β+地中海贫血和大部分α-地中海贫血患者。缺点是操作烦琐，试剂毒性大，结果不稳定，容易引起ζ 珠蛋白链假阳性。

1.5.3 高效液相色谱(HPLC) 现已用于定量分析HbA2和HbF。研究表明，采用(HPLC)技术的阴阳离子交换层析仪进行血红蛋白自动化分析及抗碱血红蛋白测定等相比，具有快速简便、结果稳定的特点。尤其对β-珠蛋白生成障碍性贫血有良好的快速诊断能力[8]。

1.5.4 毛细管区带电泳(CE)全自动毛细管区带电泳法是充满缓冲液的石英管中进行电泳技术。在溶血试剂中进行稀释的红细胞样品会被注射到毛细管的阳极端，在高电压的作用下进行分离，在阴极端415nm 波长下直接检测血红蛋白各组分含量。对HbA2可自动鉴别和定量该区带，可完美区分和聚焦HbA与HbS 之间的HbF，并可对其进行精确测定[9]。

1.5.5 全自动琼脂糖电泳全自动琼脂糖电泳是根据不同Hb 分子所带电荷不同，在电场中迁移率不同而达到分离Hb 不同成份的目的。经染色、脱色、固定，烘干后用扫描仪扫描电泳胶片，对各条区带进定量分析。可扫描得出HbA2、HbA、HbF、HbH、Hb Bart’s 及其他异常血红蛋白含量。其方法简便，电泳和染色可同时进行，所用时间短，扫描得出较准确的各组分的血红蛋白含量。电泳琼脂糖胶片容易保存，区带颜色不容易脱，区带清淅，根据HbA2、、HbA、HbF的含量能将地中海贫血初步分为α-地中海贫血和β-地中海贫血，是目前筛查地中海贫血较理想的方法。全自动琼脂糖电泳系统能准确分离各种区带，图谱可永久保存[10]。缺点是不能进行分型，且得出的HbH、Hb Bart’s 区带有些呈散在的云雾状，容易引起假阴性。因而有研究建议检测时应注意[11]，当HbA2区带淡染含量降低，异丙醇试验阳性时最好做醋酸纤维薄膜电泳报告。

2 基因诊断

基因诊断又称分子诊断，是通过对受检者某一特定基因(DNA)或某转录物(mRNA)进行分析来对遗传病进行诊断的技术。我国对地中海贫血的基因诊断多年来先后经历了DNA 点杂交、限制性内切酶酶谱分析，限制性内切片段长度多态性(RFLP)链锁分析、寡核苷酸(ASO)探针杂交和了聚合链酶反应(PCR)体外基因扩增、芯片技术等6个发展阶段。特别是PCR 及其相关发展技术，已成为最为普遍的诊断方法。

2.1 限制性内切片段长度多态性(RFLP)链锁分析原理 DNA 限制性内切酶可识别并切割DNA 上特定核苷酸序列，得到一定长度的DNA 片段，而碱基的突变可导致酶切位点的丢失或形成，从而改变酶切片段的大小。突变基因在经过相应限制性内切酶水解后，其电泳条带的数量与大小都会发生改变，根据这些改变可判断突变是否存在。缺点是不能直接测出受检者突变基因的类型，且操作繁琐。

2.2 探针斑点杂交技术(ASO) 应用引物扩增珠蛋白基因，同时合成与正常序列和突变序列完全互补的寡核苷酸探针。将PCR 扩增产物点在尼龙膜上，分别与标记的正常和突变的ASO 探针杂交，不完全互补的探针在一定条件下可完全洗脱，再从放射自显影观察杂交结果。这种检测方法快速、灵敏，缺点是对DNA的纯度和数量要求较高。目前已广泛应用于β-地中海贫血的基因诊断。

2.3 聚合链酶反应(PCR) PCR 是利用DNA 聚合酶等在体外的条件下 催化一对引物间的特异DNA 片段合成的基因体外扩增技术。以PCR为基础的诊断方法已应用于α-地中海贫血的基因诊断[12]。特别是多重PCR，它的特点是在一个PCR 体系内包含4 对等位基因的特异引物。根据每个突变位点特异扩增来判断结果。应用多重PCR 法可检测α-珠蛋白基因东南亚缺失(-SEA)、右缺失(-α3.7)和左缺失(-α4.2)。多重PCR可对缺失型α-地中海贫血进行基因分型和类别辨别[13]。利用单管多重PCR可准确、快速检测出(-SEA、-α3.7、-α4.2)用于α-地中海贫血分子筛查和产前诊断[14]。

2.4 Southern 印迹杂交 鉴别DNA 靶分子的杂交称为Southern 印迹杂交，是指DNA与DNA的杂交，将电泳分离的待测DNA 片段转印并结合到一定的固相支持物上然后用标记的DNA 探针检测待测DNA的一种方法。利用Southern 印迹杂交可以检测基因缺失。到目前为止，Southern 印迹杂交技术诊断α-地中海贫血仍然是基因诊断α-地中海贫血的金标准。

2.5 缺口PCR 其原理是设计三对或两对引物 即在缺失区域外侧，靠近缺失位点的位置设计一对引物，另外一个或一对引物在缺失区域内。在缺失区域内的引物能够在杂合子与正常人中扩增出片段，在缺失纯合子中不能扩增，在缺失区域外侧的一对引物，因为缺失使相距甚远的两端DNA 拉近，从而可扩增出特定的DNA 片段，从而检出纯合子患者。有文献报道用缺口PCR 法成功检测出三种缺失型地中海贫血[15]。

2.6 反向点杂交法 其原理与传统的等位基因特异性寡核苷酸探针点杂交的原理基本相同，所不同的是：将膜上固定探针取代固定靶DNA，经一次杂交可对未知样品中多个突变进行检测，改变了传统杂交法一次只能检测一种突变的方式。具有快速、敏感、操作简单的特点。是目前国内外最常用的技术，吕燕波[16]报道，应用此法可以同时检测β-珠蛋白基因是否发生17个点的突变。而且这种方法还可以区分突变类型的纯合子、杂合子、双重杂合子及正常基因。适用于中国人群常用见突变类型β-地贫基因检测。反向点杂交技术也应用于诊断非缺失型α-地中海贫血的点突变[17]。

2.7 荧光PCR比普通的PCR 敏感性高出1000倍以上，用不同颜色的荧光素对PCR 扩增产物进行标记，在DNA 测序仪上同时检测出不同颜色、不同片段的PCR 扩增产物，从而分辨正常人、杂合子和纯合子。应用荧光PCR的基因扫描方法，可检测广西地区最常见的几种β 珠蛋白基因突变，本法简单，快速，灵敏度高，样本DNA 用量少[18]。

2.8 基因芯片 根据基因芯片上不同位置所出现的荧光位点颜色及强弱的变化来判断地中海贫血的基因突变类型，与传统方法相比，基因芯片的诊断技术在核酸扩增的基础上，采用荧光标记引物延伸的方法，可提高检测结果的敏感性和特异性，由于基因芯片高通量特点，可将α、β 地中海贫血基因诊断在一张芯片上完成。适用于大面积的普查。地贫诊断基因芯片具有简便、省时等特点[19]。

3 小结

随着科学的不断发展，地中海贫血的实验室检测的技术也随之提高，筛查与基因诊断的的技术也越来越成熟。基层医院由于条件关系，开展基因检测比较困难，因此有必要应用多种筛查方法相结合，以提高地中海贫血诊断的准确性，为地贫基因检测分型提供依据。基因分析是最可靠的诊断在中海贫血的方法，但目前基因分析费用昂贵、操作繁锁、费时、对操作人员要求较高，限制了这方面的普及，因此费用低廉、结果可靠、使用方便、安全省时的基因诊断技术是人们盼望的事情。地中海贫血的实验室诊断技术还须精益求精，更能准确诊断地中海贫血贫血，减少漏诊和误诊，尽力创造出最为适合患者诊断的实验手段。

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