不同泥厚窖池窖泥主要功能菌及代谢产物研究

2012-04-13姚万春唐玉明任道群刘茂柯雷光电

中国酿造 2012年12期

姚万春，唐玉明，任道群，刘茂柯，雷光电，易彬

（1.四川省农科院水稻高粱研究所，四川泸州 646000；2.泸州老窖股份有限公司，四川泸州 646003）

浓香型白酒的生产以泥窖窖池为基础，窖泥质量不仅在于其理化指标丰富程度，更取决于有益功能菌的数量、活性及产物的代谢能力[1]。窖泥中栖息着大量的微生物菌群，其为严格厌氧或兼性厌氧微生物，而窖泥中微生物种类、数量及其代谢是直接影响白酒质量的关键所在[2]。发酵过程栖息在窖池窖泥、糟醅中的庞大微生物群落在糟醅固、液、气三相界面进行着复杂的物质能量代谢过程。

发酵过程中产生的黄水充当着窖泥与糟醅物质交换的载体，封窖发酵形成的窖内压力变化使酒糟中的养分和来自曲药、环境中的微生物及代谢产物，不断通过黄水进入窖泥，而窖泥中长期驯化的微生物种群及其代谢产物又不断地进入糟醅中，物质能量交换不断地影响着窖泥生态环境，促进窖泥老熟和酒质的提高[3]。然而，特定的地理、气候、泥壁厚度等环境条件造就了特定的微生物生长环境[4-5]。所以不同酒厂生产的白酒呈现出不同的风味和品质。

因此，分析窖泥中主要功能菌群的分布特征和群落结构，对于研究中国白酒风味因子形成机理、有效地控制生产环境条件和名优白酒生产的品质，有着积极的意义。本文通过对不同壁厚窖池中窖泥主要功能菌群及其代谢产物的分析，探讨窖池建造厚度对窖泥质量的响。

1 材料和方法

1.1 样品的采集

样品采自泸州老窖酒厂不同建窖厚度的窖泥。

1.2 取样方法

在窖池的窖壁四周各分5点分别取样，然后混匀。

1.3 培养基

厌氧菌培养基（aerobic culture medium）[6]：胰酪蛋白胨20g/L，氯化钠5g/L，L-半胱氨盐酸盐（L-Cysteine hydrochloride）0.4g/L，硫基乙酸钠2g/L，葡萄糖10g/L，甲醛合次硫酸氢钠10g/L，美兰（similan）0.002g/L，琼脂20g/L。pH 7.3～7.5。

甲烷菌培养基[7]：甲酸钠2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，氯化铵1.0g/L，氯化镁0.1g/L，磷酸氢二钾0.4g/L，磷酸二氢钾0.4g/L，酵母膏2.0g/L，胰化酪蛋白2.0g/L，盐酸半胱氨酸0.5g/L，刃天青（0.1%）1mL/L，甲醇5mL/L，微量元素液10mL/L，琼脂20g/L。

已酸菌培养基[8]：乙酸钠5.0g/L，酵母膏1.0g/L，硫酸铵0.5g/L，磷酸氢二钾0.4g/L，硫酸镁0.2g/L，碳酸钙10g/L，琼脂20g/L。pH 7.0～7.2。碳酸钙单独灭菌，接种前加入，同时加入乙醇2mL/L。

丁酸菌培养基[9]：胰蛋白胨10.0g/L，牛肉浸膏5.0g/L，葡萄糖4.0g/L，酵母膏3.0g/L，可溶性淀粉1.0g/L，盐酸半胱氨酸0.5g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，硫酸镁0.4g/L，氯化钙0.2g/L，硫酸亚铁0.1g/L，琼脂20g/L。pH 7.0～7.2。

丙酸菌培养基（BPYL）[10]：牛肉膏5g/L，蛋白陈10g/L，酵母膏5g/L，NaCl5g/L，乳酸钠20g/L，琼脂20g/L。pH 7.0～7.2。

1.4 窖泥微量成分分析

准确称取一定量的窖泥，加适量的乙醇研磨，定容后浸提一定时间，将上清液用微孔滤膜过滤，采用气相色谱法测定微量成分[11]。

2 结果与分析

2.1 不同建窖厚度窖池发酵过程中窖泥主要功能菌群的变化趋势

要酿制优质浓香型白酒，就必须了解优质窖泥中的主要微生物体系，了解并掌握了这个复杂的菌系，有助于制定工艺条件，促进酿酒有益菌的生长，以提高酒质[12]。因而，对不同建窖厚度的浓香型白酒窖池的窖泥主要功能菌群进行了分析，结果见图1～图5。

[30][35][38] 曹子阳、吴志峰、匡耀求、黄宁生：《DMSP/OLS夜间灯光影像中国区域的校正及应用》，《地球信息科学学报》2015年第9期，第1092-1102页。

图1 不同建窖厚度窖池发酵过程中厌氧菌数的变化曲线Fig.1 Variation of anaerobic bacteria number in cellars during fermentation with different thickness of pit mud

图2 不同建窖厚度窖池发酵过程中己酸菌数的变化曲线Fig.2 Variation of caproic acid bacteria number in cellars during fermentation with different thickness of pit mud

图3 不同建窖厚度窖池发酵过程中丁酸菌数的变化曲线Fig.3 Variation of butyric acid bacteria number in cellars during fermentation with different thickness of pit mud

图4 不同建窖厚度窖池发酵过程中甲烷菌数的变化曲线Fig.4 Variation of methano bacteria number in cellars during fermentation with different thickness of pit mud

图5 不同建窖厚度窖池发酵过程中丙酸菌数的变化曲线Fig.5 Variation of propion bacterium number in cellars during fermentation with different thickness of pit mud

由图1～图5可以看出，不同建窖厚度窖池发酵过程中窖泥主要功能菌群的分布存在以特点：

厌氧菌：从图1看出，10cm 建窖厚度窖池，第1排发酵过程窖泥中的厌氧菌数虽然大幅减少，但在过后的发酵过程中快速增加。5cm和15cm建窖厚度窖池，前1～2排发酵过程窖泥中的厌氧菌数都减少，第三排发酵过程才回升。到第3轮酿造时，10cm的菌数最多，明显多于建窖当日；5cm的菌数居中，与窖当日接近；15cm的菌数最少，明显少于建窖当日。说明人工窖泥培养过程中，由于环境条件的限制，除了厌氧和兼氧微生物大量繁殖外，还繁殖了不少的好氧菌。入窖后，由于窖内环境的改变，部分微生物因不能适应环境而快速死亡，部分微生物因条件适宜而缓慢生长。这就造成人工窖泥建窖后前1～2排发酵过程中厌氧菌数量减少，过后逐渐增多的结果。

己酸菌：5cm和10cm建窖厚度窖泥的己酸菌数的变化趋势相同，均是前1～2排发酵过程菌数逐渐减少，第3排发酵时菌数逐渐增加，到第3轮酿造时菌数均已超过建窖当日。这时10cm的己酸菌数多于5cm。15cm建窖厚度的己酸菌数在1～3排发酵过程中变化规律性不强，总的呈下降趋势。

丁酸菌：5cm和15cm建窖厚度窖泥的丁酸菌数的变化趋势相同，均是第1排酿造过程中增加，第2排酿造过程中减少，第3排酿造过程中又增加。10cm建窖厚度窖泥的丁酸菌数在第1排酿造过程中菌数逐渐减少，但之后菌数逐渐增加。第3排酿造时，以10cm建窖厚度窖泥的丁酸菌数最多。

甲烷菌：3种建窖厚度窖池在前3排发酵过程的甲烷菌数变化趋势各不相同，分别是：5cm厚度菌数逐排下降；10cm厚度第1排发酵菌数下降，之后渐渐增加，到第3轮酿造时已超过建窖当日；15cm厚度菌数是第1排发酵下降，第2排发酵回升，第3排发酵又略有下降。到第3轮酿造时15cm和10cm的菌数接近，明显多于5cm。

丙酸菌：在前3排发酵过程中，5cm建窖厚度窖泥的丙酸菌数变化不大，到第3轮酿造时与建窖当日接近；10cm建窖厚度窖泥的丙酸菌数是逐排发酵增加，到第3轮酿造时，比建窖当日提高50%左右；15cm建窖厚度窖泥的丙酸菌数前两排发酵增加，且增幅大于10cm厚的建窖泥，但第3排发酵菌数又出现下降，以至到第3轮酿造时菌数还略少于10cm。

图1～图5表明了主要功能群在不同建窖厚度窖池中栖息分布的规律，对于进一步了解、研究窖泥微生物群落变化、生态分布及对比认识这些微生物群落同产酒效应均有一定意义[13]。

2.2 不同建窖厚度窖池发酵过程中窖泥的微量化学生态环境变化

窖泥理化成分的多态性变化，如水、碳源、氮源、无机盐、生长素等的变化，还有微生物多态性引起的代谢产物，这些复杂的代谢产物与窖泥自身的无机化学成分多态性又引起发酵环境变化的多态性从而导致发酵环境中酶类和酶系及其他代谢产物的多态性变化[14]。对不同建窖厚度窖池窖泥的微量化学成分进行色谱分析，结果见图6～图11。

图6 不同建窖厚度窖池发酵过程中己酸含量的变化曲线Fig.6 Variation of caproic acid content in cellars during fermentation with different thickness of pit mud

己酸含量：3种建窖厚度窖池前3排发酵窖泥中己酸含量变化趋势各不相同，其中5cm厚度是前1～2排发酵逐渐降下降，第3排发酵小幅回升，但到第3轮酿造时仍低于建窖当日；10cm厚度是第1排发酵增加，第2排发酵过程下降到建窖当日水平，第3排发酵过程又上升。15cm建窖厚度窖泥第1排发酵过程下降，第2、3排发酵过程缓慢回升。第3排酿造时10cm和15cm的含量接近，远高于5cm。

图7 不同建窖厚度窖池发酵过程中己酸乙酯含量变化曲线Fig.7 Variation of caproic acid ethyl ester content in cellars during fermentation with different thickness of pit mud

图8 不同建窖厚度窖池发酵过程中酯类化合物含量的变化曲线Fig.8 Variation of ester compound content in cellars during fermentation with different thickness of pit mud

图9 不同建窖厚度窖池发酵过程中酯类化合物种类的变化曲线Fig.9 Variation of ester compound types in cellars during fermentation with different thickness of pit mud

己酸乙酯含量：3种建窖厚度窖池前3排发酵窖泥中己酸乙酯含量变化趋势各不相同，但总的呈上升趋势。3种建窖厚度己酸乙酯含量变化趋势分别是：5cm是前1～2发酵匀速增加，第3排发酵下降；10cm是逐排发酵增加，其中第1排发酵增速最快；15cm是第1排发酵略有增加，第2排发酵大幅增加，但第3排发酵又大幅降低。到第3轮酿造时，10cm的含量略高于5cm，明显高于15cm。

图10 不同建窖厚度窖池发酵过程中总微量化合物含量的变化曲线Fig.10 Variation of trace compound content in cellars during fermentation with different thickness of pit mud

图11 不同建窖厚度窖池发酵过程中总微量化合物种类的变化曲线Fig.11 Variation of trace compound types in cellars during fermentation with different thickness of pit mud

酯类化合物：3种建窖厚度窖泥中酯类化合物含量和种类与发酵时间的关系均是呈曲折上升的趋势。其中，10cm和15cm 2种建窖厚度窖泥的酯类化合物的含量和种数变化趋势相似，均是随发酵排次增加而增加，且二者的数值接近；5cm建窖厚度窖泥的酯类化合物含量和种数在发酵过程中变化无规律，在第2排发酵时酯的种类略有下降，而含量相反大幅增加，在第3排发酵过程中种数增加，而含量相反降低；到第三轮酿造时，10cm和15cm的酯类化合物含量和种类接近，均高于5cm。

微量化合物：在5cm和10cm建窖厚度窖泥中，随着发酵时间延长含量缓慢增加，但10cm的增速略大于5cm；在15cm建窖厚度窖泥中，前两排随着发酵时间延长含量增加，尤其是第2排发酵时含量大幅增加，但第3排发酵时含量有所降低，到第3轮酿造时还略少于10cm的含量。

3种建窖厚度窖泥的微量化合物种数变化规律相同，总的呈上升趋势。第1排发酵时增幅较大，第2排发酵时小幅下降，第3排发酵时又开始回升。10cm建窖厚度窖泥中微量化合物种类，除第1轮酿造时居于5cm和15cm之间外，其余轮次酿造时均为最高。

浓香型白酒窖泥中除上述主要功能菌群和微量化学成分外，还有许多的有益微生物和复杂成份，况且其还会随着发酵时间的变化而发生变化，对白酒的风格及个性特点起着重要作用，应根据产品的风格和个性作以一科学的总结，找出规律，还需要同仁们做大量的工作。

3 结论与讨论

优质的人工窖泥、良好的生态环境、优化的窖池结构、科学的生产工艺是快速提高新建窖池基酒质量的有效保。生产浓香型酒的窖池是一个特殊的微生物生态环境，微生物生态的特殊性造成了窖泥微量化学生态环境的特殊性，酒窖窖泥的微生物区系生态结构和微量化学生态是生产名优白酒的基础[15]。通过对浓香型酒不同建窖厚度窖泥中主要功能菌群分布和微量化学成分变化研究，初步得出以下几点结论：

（1）人工窖泥建窖后无论何种厚度的窖池第1排发酵过程中主要窖泥功能菌数几乎都减少；10cm建窖厚度的窖泥主要功能菌数从第2排发酵起就随着发酵排次的增加而增多；5cm和15cm的部分主要窖泥功能菌数在第2排发酵过程中继续减少，到第3排发酵时仍有极少数功能菌呈下降趋势。到第3轮酿造时，10cm建窖厚度的窖泥主要功能菌数都明显多于建窖当日，而5cm和15cm 2种建窖厚度的主要窖泥功能菌数除少数与建窖当日接近外，多数低于建窖当。

（2）5cm与15cm 2种建窖厚度窖池的厌氧菌数和丁酸菌数变化趋势相同，5cm与10cm 2种建窖厚度窖池的丙酸菌数和己酸菌数变化趋势相同，10cm与15cm 2种建窖厚度窖池没有变化趋势相同的窖泥功能菌。3种建窖厚度窖池的甲烷菌数变化趋势各不相同。

（3）3种建窖厚度窖池前3排发酵过程中，除己酸含量变化不大外，己酸乙酯、酯类化合物和总微量化合物的含量都是呈曲折上升的趋势，其中己酸乙酯与酯类化合物的含量变化趋势接近，且增加幅度明显大于总微量化合物。

（4）前3排发酵过程中3种建窖厚度窖池窖泥中酯类化合物种类和总微量化学成分种类的变化趋势均是曲折缓慢上升，且都是10cm与15cm的接近，这二者多于5cm。

（5）采用5cm、10cm和15cm 3种厚度建造浓香型白酒窖池，作为微生物的栖息容器都能起到吸附菌体、浓缩营养、向酒醅渗透挥发性微量成分的作用[16]，但是窖池的建造厚度对窖泥质量有明显影响。

上述研究结果结合生产成本综合考虑，建议浓香型白酒窖池建造泥壁厚度以10cm为宜。

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