雷万军，杨建英，崔 磊

基于干细胞的骨组织工程研究与临床应用

Clinical Research and App lication on Stem Cell-based Bone Tissue Engineering

雷万军，杨建英，崔 磊

目的寻找满足要求和易于操作的种子细胞。方法 参阅国内外相关文献，对近年来干细胞的骨组织工程的应用研究作一综述。结果干细胞的研究为解决组织工程种子细胞来源问题开辟了新的途径。结论满足要求和易于操作的种子细胞为脂源性干细胞。

干细胞；骨组织工程；脂源性干细胞

组织工程是应用细胞生物学和工程学的原理和技术，构建有生物活性的组织用于损伤组织或器官的修复。随着组织工程研究在世界范围内的迅猛开展，组织工程技术构建组织、器官方法的日趋完善。骨创伤修复雄厚的理论与研究基础，各种生物材料在临床治疗骨缺损的广泛应用，为骨组织工程研究提供了雄厚的基础。在此基础上，骨组织工程的研究已处于组织工程化组织构建与缺损修复的前沿，是可能率先正式进入临床应用的组织工程化组织之一。

寻找满足要求和易于操作的种子细胞是组织工程的关键环节。对于骨组织工程而言，理想的种子细胞应具有以下几个特点：取材容易，对机体的损伤小；在体外培养中有较强的传代繁殖力且成骨细胞表型不易丢失；植入机体后能适应受区生理、病理、应力等环境并保持成骨活性。早期成骨细胞多从骨膜［1］中获取，但骨膜来源的成骨细胞体外培养易造成表型丧失，无法大量扩增；要达到体内构建骨组织的细胞数，往往需要相当面积的骨膜，对机体造成新的创伤，应用受到很大限制。

干细胞的研究深入为解决组织工程种子细胞来源问题开辟了新的途径。胚胎干细胞（embryonic stem cells，ES细胞）由于具有分化全能性与体外无限增殖的能力，将是未来组织工程种子细胞的重要来源。Buttery等［2］诱导ES细胞表达成骨细胞表型，获得接近纯化的成骨系ES细胞。但ES细胞很难获得完全纯化的特定细胞系，在体内易形成畸胎瘤；而且其应用的伦理学问题尚未得到解决，目前离实际应用尚有距离。

成体干细胞中，骨髓间充质干细胞（bone marrow stem cells，BMSCs）具有多向分化潜能［3］，获取时对机体损伤小，培养扩增后数量充足，且自体细胞避免了免疫排斥反应的特点，已经成为骨组织工程最主要的种子细胞来源［4－5］。研究表明，BMSCs在骨髓中含量极低，成人骨髓平均104～105个有核细胞中含有1个hMSCs（相当于每毫升全骨髓中含有200 个BMSCs）；随着年龄的增加，细胞数量逐渐减少［6］。但是，BMSCs具有非常强的体外扩增能力，我们发现在10%胎牛血清的单层培养体系中，传至第7代时收获的细胞数为（1～2）×109，较原始接种数目扩增可达（4～6）×107倍。BMSCs是一种具多向分化潜能的细胞，因此如何在体外培养过程中使它向成骨方向转化，并在体内保持这种特性至关重要。流式细胞术表面标志检测及多向分化能力研究表明，BMSCs的干细胞特征随着传代的增加而减弱，干细胞表型在P5前维持稳定，而原代开始成骨诱导处于第3代的BMSCs成骨活性最佳［7］。

在应用骨髓间充质干细胞进行骨组织构建的过程中，生物材料作为细胞载体，为诱导分化的BMSCs提供了生长空间与骨组织形成的“模板”，因此我们研究了BMSCs在多种生物材料上的生长规律与体内成骨能力。研究证实，成骨诱导的BMSCs与藻酸钙（calcium alginate）［8］、珊瑚羟基磷灰石［9］、珊瑚［10］、脱钙骨（dem ineralized bonematrix，DBM）［11］等生物材料均具有良好的相容性。例如，单位重量脱钙骨上存在人骨髓基质干细胞的最大黏附细胞数为3.5×107／g，黏附率可达（99.1±1）%［11］。BMSCs接种于上述生物材料并植入体内后，均能够形成组织工程化骨组织。

在骨髓间充质干细胞与生物材料的体内外研究基础上，我们进一步开展了应用BMSCs进行骨组织构建与骨组织缺损修复的大动物实验研究。首先我们进行了应用BMSCs修复山羊非负重颅骨缺损的研究［12］，在2 cm×2 cm的颅骨标准缺损（critical size）中单纯植入藻酸钙凝胶，18周后骨缺损未得到任何修复；而在实验组，体外成骨诱导的BMSCs扩增后与藻酸钙凝胶复合，植入颅骨缺损部位，大体、X线、3D－CT及组织学检测均证实组织工程化骨组织形成，骨缺损得到完全修复。研究结果证实了应用组织工程技术可以修复非负重的颅骨缺损，但是骨组织工程技术能否修复具有较高力学强度要求的负重骨缺损呢？下颌骨具有一定的负重能力，下颌骨缺损是颅颌面部缺损中最常见的骨缺损。本实验室应用BMSCs复合生物材料珊瑚羟基磷灰石，修复了犬的下颌骨3 cm的节段缺损，32周组织学显示形成较好的骨性连接，力学强度则达到自体对侧下颌骨的77.01%［13］。股骨是负重能力最强的骨组织，我们应用自体BMSCs复合天然珊瑚，修复了2.5 cm的山羊股骨标准缺损，修复后32周X线显示骨密度接近正常，组织学证实骨组织形成良好，基本达到正常对侧的生物力学强度［14］。

在人体内进行骨组织构建并修复骨组织缺损，是骨组织工程研究的最主要的目标。在前述大量实验研究的基础上，我们开展了应用病人自体BMSCs构建组织工程化骨，临床修复骨组织缺损的研究工作［15］。1999～2002年，共选择颅颌面骨缺损病11例（外伤性颅骨缺损4例，先天性梨状孔周围骨凹陷畸形7例），将诱导的自体BMSCs，复合部分脱钙骨（partly demineralized bonematrix，pDBM）体外培养1周后，手术回植骨缺损区。患者三维CT检查结果示术后3～6个月能形成组织工程化骨，并修复骨组织缺损。术后1～2.5 a的随访表明组织工程骨稳定存在，无明显骨吸收现象，临床治疗效果稳定。组织工程骨活检标本HE染色显示其组织学结构和正常松质骨相同。研究结果证明以自体hBMSCs为种子细胞，利用组织工程技术可在人体内形成稳定的工程化骨组织，并临床修复颅颌面骨组织缺损。这项研究的结果为组织工程骨的临床大规模应用奠定了一定的基础。

成体干细胞中另一重要的种子细胞来源是脂肪干细胞（adipose derived stem cell，ADSCs）。研究表明，脂肪干细胞具有体外向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞等方向分化的多向分化潜能［16］。与骨髓间充质干细胞相比，ADSCs具有来源更加广泛、细胞在组织中含量多、培养条件简单且扩增能力强等特点，因此ADSCs在骨组织工程中的应用已经得到普遍重视。体内研究发现，成骨诱导的ADSCs与生物材料（羟基磷灰石－TCP）复合后，能够在免疫缺陷的裸鼠皮下形成骨样组织，提示ADSCs在骨组织工程应用中具有较大的潜能［17］。但是，应用ADSCs修复大动物骨组织缺损的研究目前尚未见报道。

以自体成体干细胞作为种子细胞进行组织工程化骨组织的构建研究，已经取得了较大的进展，并已在临床应用中得到初步证实。但是，由于自体干细胞的体外培养与扩增需要较长的一段时间，往往不能满足大多急性骨损伤的临床实际需要，能否应用同种异体干细胞进行骨组织的构建与缺损的修复，已经成为骨组织工程研究的一个新的领域。免疫学研究表明，正常状态下BMSCs不表达HLAII类抗原、B7-1、B7-2、CD40、CD40L等免疫调节分子［18］；BMSCs在体外可抑制混合淋巴细胞反应，体内系统性应用BMSCs可明显延长异体皮片移植的成活时间［19］，在造血干细胞移植时同时移植BMSCs可明显降低移植物抗宿主反应［20］。这些研究结果提示成体组织干细胞具有较为特殊的免疫学特性与免疫调节功能，同种异体的成体干细胞具有作为骨组织工程种子细胞来源的重要潜能。最近的研究［21］表明同种异体骨髓间充质干细胞复合HA／TCP能修复犬股骨2.1 mm的节段缺损，而不需要进行免疫抑制治疗。同种异体BMSCs也已在临床中用于先天性骨发育不良的治疗。而针对ADSCs的免疫学研究表明，骨髓经放射线照射灭活的小鼠体内输注ADSCs后，其造血与淋巴细胞可在体内重新生成，表明ADSCs在特定体内环境下可促进淋巴细胞的发生［22］。我们实验室的研究进一步发现［23］，ADSCs具有与BMSCs相近的低免疫原性，同时具有一定的调节免疫反应的能力，可抑制混合淋巴细胞的体外增殖反应。因此，在未来的骨组织工程应用中，可通过建立成体干细胞（骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞）库，即能更及时方便地应用组织工程方法来修复骨缺损。

组织工程是一门多学科交叉的新兴学科，各学科的研究进展通过与组织工程的学科特点相互融合，为组织工程学的发展提供了不断的动力，推动了组织工程学科的整体进步。干细胞的研究大大拓展了组织工程种子细胞的来源，为组织工程的临床应用奠定了切实可行的基础。骨组织工程即在干细胞研究飞速发展的背景下，在组织构建与临床应用等方面取得重大突破。在骨组织工程的干细胞研究中，一方面需要建立干细胞的体外标准化培养与质量控制体系，以适应骨组织工程产业化的需要；另一方面，应该结合组织工程化组织形成的生物学特点，深入研究干细胞在体外三维生长条件下及体内不同微环境中，成骨能力的变化与骨组织形成的特点，从而为组织工程化骨组织的构建提供更加优良的干细胞来源与成骨环境。

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R813

B

1672－688X（2012）04－0318－03

2012－07－10

河南科技大学医学技术与工程学院，河南洛阳471003

雷万军（1954－），男，河南巩义人，教授，从事生物医学工程教学及科研工作。

崔磊，男，教授，E-mail：cuileite＠yahoo.com.cn