黄国文

（湖南科技学院 生命科学和化学工程系，湖南 永州 425100）

叶绿体是植物特有的细胞器，是光合作用的场所。1931年Kaustky和Hirsch用肉眼观察并记录了叶绿素荧光诱导现象[1]。将暗适应的绿色植物或含有叶绿素的组织突然暴露在可见光下，叶绿体的荧光快速上升然后下降到一个稳定状态，这一现象称为Kautsky效应。荧光强度随光照时间变化的曲线称为叶绿素荧光诱导动力学曲线。在普通生物学实验的教学中开设了综合性的“叶绿体的分离和荧光观察”实验[2]，目的是使学生了解叶绿体的制备方法和叶绿体荧光产生的机理，了解荧光强度与光合作用的关系以及叶绿体活性与荧光强度的关系，培养学生对生物现象的观察和理解能力以及运用知识解决实际问题的能力。但是在这个实验中对于用差速离心法制备离体叶绿体和观察其荧光现象的步骤，大多数学生不能很好地和独立地完成。本人根据这种实际情况，研究了存在这种现象的原因，设计了一个离体叶绿体的制备和荧光现象观察的新方法—质壁分离法分离离体叶绿体并观察其荧光。应用这种方法取得的实验结果较好。

1 建立本方法的依据

1.1 叶绿体荧光现象的产生机理

当叶绿体中叶绿素分子吸收光能（光量子）后，其中的电子由低能级（基态）激发为高能电子（激发态）。不同光质激发的高能电子出现在不同的轨道中旋转。如果叶绿素分子被蓝光（430nm）激发，叶绿素中的电子跃迁到能量较高的轨道称为第二单线态；如果被红光（670 nm）激发，电子跃迁到能量较低的轨道旋转称为第一单线态。处于第一和第二单线态的电子，其自旋方向保持原来状态，如果电子在激发或退激过程中自旋方向发生变化，该电子就进入能级较单线态低的轨道称为三线态。这些高能态电子很不稳定，经过一定时间后，其能量可以同时向三个方面转化[3]。一种形态是第二单线态的高能电子返回第一单线态以及第一单线态和三线态的高能电子返回基态时产生热量，第二种形态是第一单线态的高能电子会传递给内囊体膜上的电子传递链参与光化学反应和叶绿体基质中进行有机物合成，第三形态是第一单线态和三线态高能电子返回基态产生荧光和磷光。荧光的寿命很短，只有10-8- 10-10s。这三种能量形态以竞争的方式出现，以至任何一种能量形态效率的增加会导致其它两个种能量形态产量的减少[4]。正常条件下植物捕获的光能主要用于光化学反应，剩余的能量以荧光、热耗散等方式被耗散掉[5]。叶绿素分子吸收蓝光后跃迁到较高能级第二单线态的高能电子要返回能级较低的第一单线态才能用于光合作用，多余的能量也是以热的形式耗散。因此，植物进行光合作用时对红光的能量利用率的高于对蓝光的能量利用率。

1.2 叶绿体荧光淬灭现象

在叶绿素荧光诱导过程中，荧光由最高值降至稳态，这种荧光产量的下降称为叶绿素荧光淬灭。在叶绿体的分离过程中，在2 min内叶绿体的荧光减少到稳定态[6]。在有机溶剂中叶绿素的荧光产量大约为30%，然而在进行光合作用的叶绿体的荧光产量为0.5-3%，这种现象也称为荧光淬灭。它包括光化学淬灭和非光化学淬灭。光化学淬灭是指叶绿体的电子传递链处于氧化态，反应中心开放，会发生电子传递和电荷分离，形成ATP等产生荧光淬灭，反映出PSⅡ天线色素吸收的光能用于光化学电子传递的分额和QA的氧化状态。非光化学淬灭是指PSⅡ天线色素分子吸收了过量的光能不能用于光合电子传递而以热耗散造成的光能产量降低。有机体为了免于过量光吸收的损害，产生了非光化学淬灭途径。在一个光合作用驱动的系统中，叶绿体的荧光淬灭提供了一个叶绿素被光激发与原初转换反应之间的关系[7]。所以实验材料要新鲜，用前进行充分光照，以保证叶绿体和叶绿素的活性。

2 质壁分离法制备离体叶绿体的方法

2.1 实验原理

生活细胞的原生质膜是一种选择性透过膜。当细胞外的溶液浓度较高（高渗溶液）时，细胞内的水分便向外渗出，引起质壁分离。然后锋利的刀片将已经发生质壁分离的叶片切碎，一部分细胞的细胞壁被切去。将叶片放在低渗溶液时原生质体吸水，发生质壁分离复原，这时原生质体从细胞壁的破口处释放出来。用等渗溶液(0.35 mol/L NaCl 或者0.4 mol/L蔗糖溶液)处理原生质体，原生质体破裂释放出叶绿体。可以用于观察叶绿体的形态、结构和荧光现象。

2.2 操作步骤

① 取一片叶,用刀片在背面划十字(注意：不要划破叶片)并且挑起下表皮。用镊子从四个角撕去下表皮。切成0.5 ×0.5 cm2左右的小块，转入盛有0.9 mol/L NaCl溶液的注射器中推拉几次推杆，抽去叶片中的气体。再转入盛有0.9 mol/L NaCl溶液的表面皿中浸泡10-20min。② 取3-4小块叶片放入载波片上滴有几滴0.9 mol/L NaCl溶液中，用刀片成条状切碎。③离体叶绿体的分离： 将条状切块分批转移到另外一块载玻片滴有一滴0.35 mol/L NaCl溶液中，片刻后，用镊子小心捣动并去掉叶片碎块。此时，溶液中叶肉原生质体流出、破裂并释放出叶绿体，盖上盖玻片。这时可以观察叶绿体及其荧光。注意，在载玻片上0.35 mol/L NaCl溶液中多放些叶片碎块应以溶液淹没为度。在溶液中分批转入碎块是为了收获更多的叶绿体。在载玻片上滴0.9 mol/L NaCl溶液时不能过多，以覆盖0.5 × 0.5 cm2的小块叶片为宜，溶液过多时用吸水纸吸去一部分，以防止溶液外溢。如果想获得完整的原生质体，可以将②中的条状碎块转移到载玻片上含有一滴0.6 mol/L NaCl溶液中即可。

2.3 本方法的优点

一般情况下，制备植物叶绿体的方法是差速离心法。用这种方法分离叶绿体的操作条件要求较高。因为叶绿体活力会随着离体时间延长而不断下降，因此，如果在常温下操作，应该尽可能在短时间内完成。一般要求在0-4℃条件下完成操作步骤，使离体叶绿体活性保存时间长些。但是在实验过程中一个班( 30 - 40人)同时进行、离心机和荧光显微镜通常为多人共用, 难以做到迅速分离和观察。此外，研磨叶片时不要用力过猛和连续研磨以及研磨过细，应以不延续研磨和把叶片研磨成小块为宜，在没有进行预实验的情况下研磨叶片时的力度和研磨次数难以掌握。研磨液需要用4层纱布过滤，滤液要经过逐级离心才能分离出叶绿体，这样叶绿体在体外的时间较长，增加了叶绿体荧光淬灭和活性丧失的机会。一次实验要使用较多材料（30 g左右）来提取叶绿体，否则经过研磨、过滤和分级离心以后得到的叶绿体的数量非常少，这样也减少了每个学生动手操作实验的机会。

运用质壁分离法制备离体叶绿体，操作简单，不需要组织捣碎机和离心机等设备。所用的实验材料少，适合每一位同学动手操作实验。制备叶绿体的步骤少，所需的时间短，可以有效保存叶绿体的活性，减少叶绿体荧光淬灭的机会，观察到的叶绿体的荧光现象明显，实验结果好。

3 观察叶绿体荧光现象

3.1 离体叶绿体与细胞内的叶绿体荧光强度比较

将制备好的离体叶绿体装片和叶肉装片放在荧光显微镜下观察，可见离体叶绿体的荧光要比细胞内的叶绿体的要亮。这是由于离体叶绿体光合作用的光反应受阻引起的。因为植物光合作用的光反应在叶绿体类囊体薄膜上进行。叶绿素分子吸收光能，被激发出一个高能电子。这个电子则在类囊体膜上的电子传递链传递下去，并将 H+质子从叶绿体基质泵入到类囊体腔，建立电化学质子梯度，用于 ATP的合成，NADP+接受高能电子被还原为NADPH。叶绿素分子由于失去一个电子，就留下一个空穴，只得从周围的水分子中夺得电子，因而促使水的分解。由于离体叶绿体基质中ADP+和NADP+和CO2有限，不能从细胞质中得到补充，高能电子的传递受阻，其能量重新以荧光形式发射出来，所以其荧光强度较亮；在同等光照强度的情况下，细胞内的叶绿体的光合作用能够顺利进行，叶绿素分子吸收光照产生的激发能主要用于光合作用，叶绿素发射的荧光量子就少，其荧光强度就低[8]。同样地，离体叶绿素的荧光比细胞内的荧光要强。这是因为离体叶绿素没有结合在叶绿体中的类囊体上，叶绿素分子受到光能激发产生的高能电子的能量不能传递到电子传递链重新被发射出来，所以荧光强度较强；然而细胞中叶绿素分子结合在类囊体上，在同等光照强度的情况下叶绿素分子受到光能激发产生的高能电子的能量能可以传递到电子传递链进行光化学反应，能够被发射出来的荧光量就少，所以荧光强度就弱。

3.2 不同滤光片下叶绿体自发荧光的比较

在荧光显微镜下换用不同滤光片观察叶绿体装片，可见叶绿体的自发荧光会发生变化，叶绿体的颜色相应地发生改变。这是因为叶绿体的荧光特征基本上是由吸收光的色素、激发能的转移和产生荧光色素的特性决定的，也受反应中心和 PSⅡ的电子供体和电子受体的还原状态的影响，还受温度、光照强度、水分等环境因素的影响。在植物体内由于激发能从ch1b 向ch1a 的传递效率几乎达到100% , 所以PSⅠ色素系统基本不发荧光，检不出体内ch1b 的荧光。在室温下，细胞内和离体叶绿体的荧光几乎都是来源于 PSⅡ的Chl a，发射的荧光产量和动力学是与PSⅡ的原初光化学反应密切相连的[9,10]。植物进行光合作用时，叶绿体分子吸收的光主要是蓝光和红光(400-700 nm, 它被称为光合作用有效辐射)，然而叶绿体产生的荧光主要在红光至几乎红外光(660-800 nm)区。叶片中叶绿素产生的荧光有两个最大值：红光区（大约686-690 nm）和远红光区（大约730-740 nm）[11]，所以荧光是叶绿素吸收光能以后重新以光的形式发射出来的波长较长的光。在介质中没有添加辅助因子（维生素C、维生素K13，AMP + Mg2++ FMN + TPN）的离体叶绿体的荧光诱导现象比完整叶片里的叶绿体的荧光诱导现象明显地简单[12]。

总之，运用质壁分离法制备离体叶绿体和荧光观察的方法，能够克服用差速离心法制备叶绿体耗时、叶绿体活性难以保证等缺点；能够清楚地观察到离体叶绿体的自发荧光现象，也为观察叶绿体的次生荧光现象打下了基础。在我校生物技术专业的实验教学中，运用这一方法，每一组的学生都能动手完成实验，能够制备到有活性的离体叶绿体并且清楚地观察到荧光现象的学生人数达到95%以上。这一方法将会在今后的学生分组实验教学中得到有效的应用。

[1]Govindjee.Sixty-three years since Kautsky: chlorophyll a fluorescence[J].Aust J Plant Physiol, 1995, 22: 131—160.

[2]彭玲主编.普通生物学实验[M].武汉:华中科技大学出版社,2009,p65.

[3]Rohácek K, and Barták M.Technique of the modulated chlorophyll fluorescence: basic concepts, useful parameters,and some applications[J].Photosynthetica, 1999, 37:339-363.

[4]Maxwell K, Johnson GN.Chlorophyll fluorescence - a practical guide[J].Journal of Experimenral Botany, 2000,51:659-668.

[5]Krause GH and Weis E.Chlorophyll fluorescence and photosynthesis: the basics[J].Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 1991, 42: 319-349.

[6]Thomas JB, Voskuil W, Olsman H, De Boois HM.Fluorescence-induction phenomena in isolated chloroplasts[J].Biochim.Biopkys.Acta, 1962，59: 224-226.

[7]Arnon DI, TsuJimoto HY, and Mcswain BD.Quenching of chloroplast fluorescence by photosynthetic phosphoryla tion and electron transfer[J].Biochemistry, 1965, 54:927-934.

[8]Arnon DI, Tsujimoto HY, and McSwain BD.Quenching of chloroplast fluorescence by photosynthetic phosphorylation and electron transfer[J].PNAS, 1965, 54:927-934.

[9]Homann PH.Cation Effects on the Fluorescence of Isolated Chloroplasts[J].Plant Physiol.1969, 44, 932-936.

[10]Oxborough K.Imaging of chlorophyll a fluorescence:Theoretical and practical aspects of an emerging technique for the monitoring of photosynthetic performance[J].Journal of Experimental Botany, 2004, 55: 1195- 1205.

[11]Buschmann C .Variability and application of the chlorophyll fluorescence emission ratio red/far-red of leaves[J].Photosynthesis Research, 2007,92: 261-271.

[12]Thomas JB, Voskuil W, Olsman H, De Boois HM.Fluorescence-induction phenomena in isolated chloroplasts[J].Biochim.Biopkys.Acta, 1962，59: 224-226.