游建,周岩

（河南科技学院,河南新乡453003）

在转基因植物中,导入植物体内的外源基因除了目的基因之外,还有选择标记基因及其他相关基因.目的基因是用来优化或赋予植物特定性状的基因；选择标记基因则能赋予转基因植株抗某种抗生素或除草剂等特性,在转基因过程中的使用可以大大提高转基因植物筛选的效率.除了目的基因,人们对转基因植物的担忧主要集中在标记基因上,尽管还没有确切的证据证实标记基因确实存在安全隐患,但标记基因的安全性问题已受到世界各国政府和组织的重视,并已成为限制转基因植物产业化和商业化发展的主要瓶颈[1].如何删除标记基因以提高转基因植物的安全性一直是基因工程研究的热点之一,研究人员已先后发展了如共转化[2]、位点特异性重组系统[3]、转座子法[4]等手段来删除转基因植物中的标记基因,从而提高基因工程中标记基因的安全性,并已取得丰硕成果.位点特异性重组系统,由于其在标记基因删除过程中有较高的删除效率和删除精确性,因此在删除转基因植物标记基因,获得无标记基因作物方面发挥着重要作用[5].近年来,运用位点特异性重组系统在去除水稻、烟草、柑橘等转基因植物标记基因方面的研究已有大量报道[6-8].来源于啤酒酵母的FLP/FRT位点特异性重组系统由于具有较高的删除效率和删除精确性,已经被广泛应用于烟草、拟南芥、水稻等高等真核模式植物的研究中,实现了基因敲除、基因插入、点突变、缺失突变、染色体组大片段删除等基因工程操作[9].本文主要就FLP/FRT位点特异性重组系统的基本概况及其在植物基因工程中标记基因删除方面的应用进行概述和评价.

1 FLP/FRT位点特异性重组系统概况

FLP/FRT系统来自于啤酒酵母（saccharomyces cerevisiae）细胞内的2 μm双链环状DNA质粒.2 μm双链环结构上最为显著的特点是存在2个9 bp的反向重复序列.由于2个9 bp的反向重复序列之间可以发生DNA片段重组,因此,酵母细胞中的2 μm双链环结构存在2种不同的可以互变的构型,这种行为使得2 μm双链环在酵母细胞中的能够维持较高的拷贝数.后续研究发现,2 μm双链环分子内发生的DNA重组属于受特异性酶催化的位点特异性重组.1980年,Broach等[10]将催化这一特异性重组反应的由flippase基因编码的重组酶命名为“FLP”（flippase recombination enzyme）.FLP是特异性重组酶,作用的靶序列为2 μm双链环的2个反向重复序列中包含有3个13 bp的FLP重组酶结合区和1个8 bp的含限制性酶切位点的非对称间隔区的共48 bp的FRT位点（FLP recombination target）.自1993年Lyznik等[11]利用FLP/FRT系统瞬时转化玉米和水稻的原生质体以来,FLP/FRT系统已被广泛应用于烟草、拟南芥、杨树等高等真核模式植物的研究中,并在实践中得到不断的改良和发展,是目前转基因动植物研究领域进行基因操作的强有力的工具.FLP/FRT系统在植物基因工程中主要有3个方面的应用：定点转化植物、删除标记基因、特定组织器官或发育时期删除转入的外源基因[12].其中,删除筛选标记基因是FLP/FRT位点特异性重组系统的重要应用.

2 FLP/FRT位点特异性重组系统在标记基因删除中的应用

按照工作原理及切除过程的不同,FLP/FRT位点特异性重组系统大致可划分为3种基因删除方式,即：简单删除、控制删除及高效删除.

2.1 简单删除

简单删除是FLP/FRT位点特异性重组系统最先采用的删除方式.研究者首先要构建两个载体,一个载体上构建有FLP重组酶基因,另一个载体则构建有2个同向的FRT序列,选择标记基因位于2个同向的FRT序列之间.利用构建好的载体转化不同植株,获得分别FLP重组酶基因和2个同向的FRT序列的植株,再将转化体进行有性杂交,后代经分离获得无标记基因的植株，或者通过二次转化的方法删除筛选标记基因.自从Lyznik[11]等首次利用二次转化将FLP/FRT系统用于玉米和水稻的原生质体转化瞬时表达以来,许多研究者对此进行了大量尝试,并取得了较大成功.Kerbach等[13]于2005年通过有性杂交的方式首次将FLP/FRT系统引入到玉米植株中,但是在转基因后代中检测到的删除效率很低,7株杂交后代仅有1株检测到了删除事件的发生.单晓映等[14]利用二次转化的方法分别将两侧含有FRT位点的乙酰乳酸合成酶als基因作选择标记基因和含有由热诱导启动子hsp70控制的FLP重组酶基因转入烟草中,获得了烟草转化植株,建立了可在植物中广泛应用的FLP/FRT位点特异性重组系统.热激处理诱导热诱导型启动子hsp70调控的重组酶FLP基因的表达后,获得了41%的二次转化植株选择标记基因als的有效删除率.Hu等[6]则将构建含有卡那霉素抗性基因（nptⅡ）和gus报告基因的水稻品系与含有编码FLP重组酶基因的水稻品系通过有性杂交获得了无卡那霉素抗性标记基因的转基因水稻,F1代水稻植株体内FLP介导的卡那霉素抗性标记基因删除效率达到了25.6%,实现了标记基因的有效删除.Li等[15]首先将拟南芥中能提高植物耐碱性的Na+/H+反向运输蛋白基因AtNHX1转入玉米基因组,获得了含有反向运输蛋白基因AtNHX1和乙酰乳酸合成酶标记基因als的转基因玉米.通过与转化FLP重组酶基因的转基因玉米杂交,杂交F1代能有效利用FLP/FRT系统删除乙酰乳酸合成酶选择标记基因,删除效率达到40.7%,同样实现了标记基因的有效删除.

通过二次转化FLP重组酶基因或与转化FLP重组酶基因的转化植株进行有性杂交从而引入重组酶基因来实现标记基因的删除,转化植株需要进行自交分离筛选无重组酶基因以及转化重组酶基因时带入的另一个选择标记基因,使得无选择标记基因转基因后代选育周期过长.另外,二次转化首先需要建立一个高效的遗传再生体系.然而,对于转基因困难的作物来说由于其较低的转化效率,限制了二次转化的应用.此外,有性杂交方法也不适合无性繁殖作物.无论是二次转化还是有性杂交的方式引入重组酶基因转入由于其工作量大,周期长,删除效率低,不受人为控制,标记基因的删除效率不高等缺陷限制了其在植物遗传改良中的应用.

2.2 可控删除

通过简单删除方式需要通过后代自交分离进一步去掉重组酶基因及转化重组酶基因时所带入的另一个选择标记基因,使得无选择标记转基因作物的选育周期过长,删除效率不高,且受体范围只局限于有性生殖的植物.针对以上不足,研究人员发展了新的标记基因控制删除技术即将FLP重组酶基因和目的基因、FRT位点、选择标记基因等都构建到同一个植物表达载体上,将要删除的选择标记基因和FLP重组酶基因置于2个同向的FRT位点间,采用特异性启动子,如化学诱导或热诱导等诱导型启动子、种子或花等组织特异性启动子等,来启动FLP重组酶基因的表达,实现目的基因的删除[16].自从Kilby等[17]首次采用大豆热激蛋白基因启动子Gmhsp17.6-L实现了对重组酶FLP基因表达的可控性诱导后,利用各种诱导型启动子控制诱导重组酶基因的表达,从而实现对转基因植物选择标记基因进行时空可控性删除日益受到研究人员的亲睐[9].Deng等[18]利用构建的含有置于2个同向的FRT位点间的重组酶FLP基因和转录因子基因（babyboom,BBM）的载体pLFFP-BBM转化中国毛白杨.其中,重组酶FLP基因由热激诱导启动子HSP18.2控制，BBM由35S启动子驱动.在毛白杨的体细胞胚胎建成过程中,BBM的过量表达使得毛白杨的体细胞胚能够再生出表型变异的转基因植株,经过热激处理诱导重组酶的表达,使得BBM被删除,从而植株表型恢复正常.体细胞胚胎发生系统可以在不使用任何选择剂的情况下,利用体细胞胚再生无标记转基因植株.Woo等[19]利用多重胁迫诱导的过氧化物酶（POD）启动子诱导FLP重组酶表达,在附加有过氧化氢的条件下,删除了转基因烟草中作为选择标记的潮霉素磷酸转移酶hpt基因,获得的F1代转基因植株中选择标记基因的删除效率最高可达41%.Fladung[20]利用构建的含有置于2个同向的FRT位点间大豆热诱导启动子HSP17.5-E驱动的重组酶FLP基因和35S启动子驱动的nptⅡ基因的载体pTex转化山杨.经过热激诱导,65.2%的转化再生植株成功地删除了FLP和nptⅡ基因.有研究者同样研究了FLP/FRT系统在杨树遗传改良中进行筛选标记基因移除和目的基因转移中的可行性,其研究结论显示FLP/FRT系统可以在杨树中介导高效的筛选标记移除和进行精确的基因定向整合.从理论上说,由于热激处理等诱导处理转基因植物的时间和频率都可以人为控制,故可以自由控制转基因植物中外源基因的删除.但是,如果将其应用于大田大规模种植的转基因作物去解决转基因安全性等问题,仍然存在可操作性以及删除有效性等障碍.

在控制删除阶段,位点特异重组系统利用可控制的自我删除途径,克服了二次转化和有性杂交等删除方式转化效率不高,操作周期长等弊端,同样适用于无性繁殖的植物,一步即可获得目的植株,大大简化了操作步骤,实现对基因靶位点时空上的精确调控,从而获得无标记基因的转基因个体,在烟草、拟南芥等双子叶模式植物中得到了广泛的应用.在转基因植物的T0代通过控制诱导重组酶基因的表达就可以实现标记基因的有效删除,缩短了标记基因和重组酶基因的删除时间,避免了由于重组酶的过量表达对植物的伤害.采用可控的诱导型启动子虽然克服了简单删除阶段二次转化和有性杂交的不足,但早期的研究中由于启动子驱动能力不足,另外FLP重组酶表达量较小,造成删除效率普遍较低.较低的删除效率,尤其是单子叶植物中的较低的删除效率,在很大程度上限制了可控删除系统在获得无选择标记转基因植物中的生产应用.

2.3 高效删除

高效删除实际上是对控制删除的进一步改良和发展.高效删除阶段一方面通过采用启动能力强的强启动子如组织特异性启动子,另一方面通过在载体中插入促进重组酶和特异性位点识别或结合的序列来改进载体构建策略,从而提高重组酶的表达量以及与特异识别位点的结合能力,从而提高删除效率.近年来,Luo等[21-23]在利用改良型的杂合loxP-FRT识别位点进行标记基因的高效删除与基因整合方面,进行了大量研究.2005年,Luo等[21]采用来自于拟南芥的热激蛋白Hsp18.2基因启动子控制重组酶基因FLP的表达,同时以GUS基因作为报告基因,抗生素抗性基因（NPTⅡ）作为筛选标记基因,构建了一个新的重组酶删除系统.该系统采用loxP-FRT融合识别位点代替传统的单识别位点,将所有外源基因置于重组酶系统的两个识别点之间,当获得转基因植株后,采用热激处理的方式启动重组酶基因的表达,迅速删除转基因植物中所有外源基因,获得了高达84.9%的删除效率.2007年,罗克明等[22]在其构建的改良型的杂合loxP-FRT识别位点间加入8 bp的间隔序列融合构成一个新的杂合识别位点loxP-FRT,即GM-gene-deletor,对烟草的转化试验结果表明,以来自拟南芥的种子组织特异性启动子PAB5驱动的重组酶Cre和FLP基因同时表达时其删除效率在一个较低水平；当Cre或FLP基因单独表达时可显著提高位点特异性重组酶系统在转基因植物中对外源基因的删除效率,删除效率可达100%,并且在转基因自交或杂交后代种子中的外源基因删除率达到了100%,同时证明了这种删除系统能在无性生殖后代中得到稳定的遗传.值得注意的是在GM-gene-deletor系统中,当Cre和PLP重组酶同时表达时,其删除效率非常低.但是,当重组酶Cre或FLP单独表达时,其对外源基因的删除效率达到了100%.Luo等[23]在烟草中利用来自拟南芥的热诱导型启动子Hsp18.2控制FLP重组酶表达,删除了位于2个loxP-FRT位点之间的异选择标记基因（ipt）、报告基因β-葡萄糖苷酸酶基因（gusA）以及FLP重组酶编码基因,获得无选择标记的转基因烟草.所构建的GM-gene-deletor系统大大提高了包括选择标记基因以及改良植物抗性和品质的目的基因在内的所有外源基因的删除效率（试验证明其删除效率可达到100%）,减轻了公众对于转基因作物或者食品的一系列担忧.人们不必担心转基因作物中的标记基因通过种子或花粉以“基因漂流”等方式流入自然界中,也不用担心转基因作物中携带的外源基因和蛋白对人体产生的副作用,有力地推动了转基因产品的商业化进程.虽然,GM-gene-deletor可以将所有的外源功能基因进行删除,但是FLP酶切口处仍保留了一段86 bp的无蛋白质编码功能的loxP-FRT序列,这样就仍然含有冗余的外源DNA序列.所幸的是,时至今日尚无有力证据表明这种“残留”对于环境和人体健康具有威胁.

3 小结

研发和应用转基因植物安全技术体系,是转基因植物研究健康发展的重要保障,也是推动转基因作物商业化和产业化的重要突破口.FLP/FRT位点特异性重组系统为无标记转基因植物的获得提供了一个重要的手段.在应用中,可以通过二次转化或与含重组酶基因的转基因植株杂交来组成性表达重组酶,或利用瞬时表达、诱导性表达、组织特异性表达重组酶来剔除选择标记基因.FLP/FRT位点特异重组系统的不断改善和发展一方面为农作物复杂性状的改良提供了可能,实现了转基因植物的持续改良.另一方面,会一定程度上消除转基因植物对人类健康和环境安全等方面造成的隐患,加速转基因作物的商业化和产业化.另外,FLP/FRT位点特异重组系统发展在改进植物表达载体、创建优良的育种材料以及利用可控制的基因删除技术研究基因的功能以及细胞信号传导途径的研究等方面也日益凸显其无可比拟的优越性.尽管目前FLP/FRT位点特异重组系统研究和应用仍存在诸多不足,如融合2个位点的杂合系统反应机制还缺乏充足的理论依据；FLP/FRT系统往往会因为该系统在某些种类的生物中较低的重组效率而受到影响.但随着科研人员研究的不断深入,FLP/FRT系统在后基因组时代基因功能的研究,特别是实现对靶基因的定点删除与调控、生产具有商业价值的转基因植物等生物技术应用领域的研究方面,必将发挥重要的作用.

[1] Hare P D,Chua NH.Excision of selectable marker genes from transgenic plants[J].Nature Biotechnology,2002,20（6）：575-580.

[2] Komari T,Hiei Y,Saito Y,et al.Vectors carrying two separate T-DNAs for co-transformation of higher plants mediated by Agrobacterium tumefaciens and segregation of trans for mants free froM Selection markers[J].The Plant Journal,1996,10（1）：165-174.

[3] Sonti R V,Tisser A F D,Wong J F,et al.Activity of the yeast FLP recombinase in Arabidopsis[J].Plant Molecular Biology,1995,28（6）：1127-1132.

[4] Yoder J I,Goldsbrouugh A P.Transformation system for generating marker-free transgenic plants[J].Nature Biotechnology,1994,12：263-267.

[5] Kilby N J,Snaith M R,Murray J A H.Site-specific recombinases：Tools for genome engineering[J].Trends Genetics,1993,9(12)：413-421.

[6] Hu Q,Kononowicz-Hodges H,Nelson-Vasilchik K,et al.FLP recom binase mediated site specific recombination in rice[J].Plant Biotechnology Journal,2008,6（2）：176-188.

[7] ChakrabortID,Sarkar A,Mondal H A,et al.Cre/lox system to develop selectable marker free transgenic tobacco plants conferring resistance against sap suckinghomopteran insect[J].Plant Cell Report,2008,27（10）：1623-1633.

[8] Ballester A,Cervera M,Pena L.Efficient production of transgenic citrus plants using isopentenyl transferase positive selection and removal of the marker gene by site specific recombination[J].Plant Cell Report,2007,26（1）：39-45.

[9] 赵爱春,龙定沛,谭兵,等.FLP/FRT位点特异性重组系统在高等真核生物中的研究进展[J].中国农业科学,2011,44（15）：3252-3263.

[10] Broach J R,Hicks J B.Replication and recombination functions associated with the yeast plasmid,2 μ circle[J].Cell,1980,21（2）：501-508.

[11] Lyznik L A,Mitchell J C,Hirayama L,et al.Activity of yeast FLP recombinase in maize and rice protoplasts[J].Nucleic Acids Research,1993,21（4）：969-975.

[12] OwDW.2004 SIV Bcongress sy mposium proceeding：transgene management via multiple site-specific recombination systems[J].In VitroCellular and Developmental Biology Plant,2005,41（3）：213-219.

[13] Kerbach S,Lorz H,Becker D.Site specific recombination in Zea mays[J].Theoretical and Applied Genetics,2005,111（8）：1608-1616.

[14] 单晓映,李蓓,张举仁.利用FLP/FRT重组系统产生无选择标记的转基因烟草植株[J].生物工程学报,2006,22（5）：744-750.

[15] Li B,Li N,Duan X,et al.Generation of marker-free transgenic maize with improved salt tolerance using the FLP/FRT recombination system[J].Journal of Biotechnology,2010,145（2）：206-213.

[16] Kopertekh L,Broer I,Schiemann J.Developmentallyregulated site-specific marker gene excision in trans genic B.napus plants[J].Plant Cell Reports,2009,28（7）：1075-1083.

[17] Kilby N J,Davies G J,Snaith MR,et al.FLP recombinase in transgenic plants：constitutive activity in stably transformed tobacco and generation of marked cell clones in Arabidopsis[J].The Plant Journal,1995,8（5）：637-652.

[18] Deng W,Luo K M,Li Z G,et al.A novel method for induction of plant regeneration viA Somatic embryo genesis[J].Plant Science,2009,177（1）：43-48.

[19] Woo H J,Cho H S,LiMS H,et al.Auto-excision of selectable marker genes from trans genic tobacco via AStress inducible FLP/FRT site-specific recombination system[J].Transgenic Research,2009,18（3）：455-465.

[20] Matthias F,Tobias MH S,Olaf P,et al.Elimination of marker genes and targeted integration via FLP/FRTrecombination system fromyeast in hybrid aspen（Populus tremula L.×P.tremuloides Michx.）[J].Tree Genetics and Genomes,2010,6（2）：205-217.

[21] 罗克明,赵德刚,Li Y,等.一个新的重组酶系统在转基因植物外源基因删除中的应用[J].高技术通讯,2005,15（7）：61-66.

[22] Luo K,Duan H,Zhao D,et al.GM-gene-deletor：Fused loxP-FRT recognition sequences dramatically improve the efficiency of FLP or CRE recombinase on transgene excision from pollen and seed of tobacco plants[J].Plant Biotechnology Journal,2007,5（2）：263-274.

[23] Luo K,Sun M,Deng W,et al.Excision of selectable marker gene from transgenic tobacco using the GM-gene-deletor system regulated bya heat inducible promoter[J].Biotechnology Letters,2008,30（7）：1295-1302.