李文滨，李胜畅，王志坤

（1.东北农业大学农学院，哈尔滨 150030；2.大豆生物学教育部重点实验室，哈尔滨 150030）

植物生长在一个千变万化的环境中，会受到干旱、低温以及病原侵染等逆境胁迫，植物细胞在染色体DNA水平、转录水平以及转录后水平上对基因表达进行精确调控，以适应环境的变化[1]。受环境胁迫诱导表达的基因可分为两类：一类是基因编码的蛋白产物，使植物细胞直接具有抵御环境胁迫的功能，如胚胎后期发育丰富蛋白（LEA蛋白）、渗调蛋白、离子区域化和水通道蛋白、抗冻蛋白、脯氨酸、果聚糖合成酶及甜菜碱合成酶等；另一类是基因编码的调控产物，在植物胁迫应答中具有信号传导和调控基因表达的功能，如感应和传导胁迫信号的CDPK、MAPK等蛋白激酶，以及参与调控基因表达的bZIP类、bHLH类、NAC类、DREB类、ERF类、RAV类、WRKY和MYB类等转录因子[2-3]。

转录因子（Transcription factor，TF）又称反式作用因子，是能够与基因启动子区域中的顺式作用元件发生特异性结合，从而保证目的基因以特定的强度、在特定的时间与空间表达的蛋白质分子相结合[4]。植物许多基因的表达都是由特定的转录因子与特定的顺式作用元件相互作用调控的。

核因子Y是成员最多的植物特异转录因子之一。在酵母和哺乳动物中，其中每个亚基一般只有一个基因编码。在植物中，每个亚基类已被大大扩展，分别由几个或更多个基因编码。这样的家族扩展，提供了更多的NF-YA/NF-YB/NF-YC三聚体组合，并大量增加了核因子Y功能复杂的潜力，成为一个广泛调控系统。这表明了不同的核因子Y在植物中比在其他生物中更复杂的调节作用。

1 植物核因子Y的结构特点及其分类

核因子Y是一种普遍存在的转录因子，由三个不同的亚基组成：NF-YA、NF-YB和NF-YC。在真菌和动物中，每一个亚基由一个基因编码；而在植物中每个亚基是由多个基因编码的。NF-YA亚基有两个功能上很保守的核心结构域，N端结构域和NF-YB/C相互作用，C端结构域和DNA相互作用。NF-YB和NF-YC两个亚基的保守结构域也包括一些和DNA相互作用的残基。NF-YB主要对NF-YA与DNA的结合起促进作用[5]。NF-YB和NF-YC亚基包含有高度保守的蛋白折叠序（Histone-fold motif，HFM），并且结构上和核心组蛋白亚基H2B和H2A相似[6-8]。与植物、脊椎动物和酵母的NF-YA高度保守核心区相比，NF-YB和NF-YC亚基的核心序列不是保守的。

核因子Y是一种典型的通过和调控因子相互作用来调控下游基因表达的转录因子。NF-Y转录因子含有保守专一性的序列，该序列和真核生物启动子区域的CCAAT框相结合。CCAAT盒是在真核启动子中最常见的启动子元件之一，它通常是位于60～100 bp的转录起始位点上游，并在正反两个方向直接起作用[9-12]。在多物种中，无论是存在的位置、方向上，还是结合的核苷酸的数目上，CCAAT盒都是高度保守的同源基因序列[8]。在所有真核生物中，CCAAT盒转录调节组件是一个顺式调控元件，并且存在于约30%的基因的启动子区域[13]。基因表达模式可以是组织或阶段特异性的，也可以由其他顺式和反式作用因子决定，而由包含CCAAT盒的启动子来控制基因的表达可能是无处不在的。多个反式作用因子与CCAAT盒相联系，但只有核因子NF-Y是和CCAAT这5个核苷酸相结合[10]。

在真菌中，酵母（面包酵母）HAP由HAP2/3/5三个亚基组成，即HAP2（也称为NF-YA或CBF-B）、HAP3（NF-YB/CBF-A）和 HAP5（NF-YC/CBF-C），结合CCAAT盒并控制靶基因的表达。每个亚基含有一个保守结构域，主要和DNA、蛋白质相结合。在双子叶植物拟南芥中，HAP亚基的几个成员是由爱德华兹等在1998年第一次鉴定得到的。基因组中编码10个NF-YA/HAP2亚基基因，13个NF-YB/HAP3亚基基因，13个NF-YC/HAP5亚基基因[14]。在单子叶植物水稻中，克隆了10个HAP2亚基基因，11个HAP3亚基基因，7个HAP5亚基基因[15]，HAP2和HAP5亚基基因未被报道过，只对6个HAP3亚基基因做了详细研究[16-17]。在小麦中有37个NF-Y亚基基因，包括10个NF-YA亚基基因，13个NF-YB亚基基因，14个NF-YC亚基基因，还有两个Dr1蛋白，包括 Dr1（NC2b）和 Drap1（NC2a）[18]，分别和NF-YB、NF-YC相联系[19]。在小麦中建立了整个基因组DNA分析研究的数据库，根据保守的核心区域，每个NF-Y的亚基家族可进一步划分为4～5个分支。通过比较小麦、水稻和拟南芥的核因子Y的成员结构，几个保守结构域以外的NF-Y的核心区域也被确定出来[19]。

2 植物NF-Y转录因子的生物学功能

2.1 核因子Y在植物抗旱中的作用

陆生植物在克服干旱时会引起复杂的反应特性，但个别信号转导通路调控表达已经成为一种调节植物抗旱性增强的良好策略。这种方法将适用于干旱地区种植的多种作物。这些作物已经证实通过功能基因组学的方法在拟南芥模式植物中确定新的克服干旱的途径，并与作物生产实际应用相联系。

拟南芥的nf-yb5基因在抗旱方面具有重要作用。拟南芥nf-yb5的转录受到抗旱的强烈诱导，主要在微观组织和保卫细胞中高度表达，超表达拟南芥nf-yb5的植株在干旱胁迫时，表现为叶片失水减少，花青素含量增加，因而植株抗旱性大为提高[14]。在拟南芥中，LEC1、LEC1-like蛋白和NF-YB亚基蛋白，都被认为是对干旱反应起到至关重要的物质。在系统发育和功能上，拟南芥LEC1和LEC1-like蛋白又不同于NF-YB亚基蛋白。如拟南芥NF-YB1亚基很可能是一个非LEC1-like的NF-YB亚基，它和拟南芥LEC1和LEC1-like蛋白相关或者相重叠。在干旱条件下，拟南芥nf-yb1两个独立的T-DNA插入株系无法检测和显示对于干旱反应的变化。说明此基因是一种耐旱性的NF-Y转录因子。拟南芥nf-yb1基因的抗旱途径是一种与报道公认的ABA抗旱途径和CBF4途径不同的新抗旱途径[20]。

玉米nf-yb2被用来构建一种新型的转基因玉米品种。它结合一段DNA区域，该区域是由水稻的actin1蛋白的组成型启动子和内含子连接到玉米的基因上。转基因玉米在抗旱方面表现突出[20]。在干旱条件下，转nf-yb2基因玉米植株较野生型植株表现：叶片叶面积减小，叶片不萎蔫，叶片温度低。叶绿素指数增高、光合速率增强、较高的气孔电导率。过量表达拟南芥nf-yb1基因的转基因玉米改善了玉米产量并且增强了植株的抗旱性[20]。

在全球，主要有四个小麦出口国（阿根廷、澳大利亚、加拿大和美国）在作物生长的中度至重度干旱的条件下拥有最大的小麦生产总量。这也是对小麦产量的主要非生物约束[21]。从模式植物拟南芥和水稻基因序列信息出发，从核苷酸序列数据库中比对出所有小麦核因子Y的亚基成员，确定了NF-Y模式亚基基因家族，并确定了其基因的表达谱。小麦nf-y基因的表达普遍存在，NF-Y家族每一个亚基的基因成员主要在胚乳中表达。而其他一些基因在一特定器官中表达。通过定量RT-PCR分析显示：在小麦叶片中，9个nf-y和2个dr1基因表达似乎对干旱胁迫反应起作用。这些基因中的三个基因在干旱条件下表达是上调的，说明了这些基因都可能与植物适应干旱有关。通过基因组合式表达及系统发育进化树分析表明，在同一进化分支中各个成员普遍认同为一个类似的表达谱。器官特异性表达和对干旱的差异分析，转录因子家族各成员有特定的生物学作用。

干旱影响超过10%的耕地，减少了50%主要农作物的平均产量[22]。非生物胁迫严重影响产量，如植物细胞周期进程，代谢率和生理平衡许多生物过程。转录因子像个复杂的开关调控这些生理生化过程[23-24]。

2.2 核因子Y在植物胚胎发育和叶绿体功能形成中的作用

遗传分析第一个植物核因子Y的基因LEAFY COTYLEDON 1（lec1）和LEAFY COTYLEDON 1 LIKE（l1l），它们在胚胎发育、种子成熟和编码核因子-B类的旁系蛋白中起到关键作用[25-26]。拟南芥LEAFY COTYLEDON1（lec1）通过功能缺失突变分析和获得性功能分析，被证明是一个胚胎发育调控的关键基因[27]。LEC1-like（lec1-like）是和lec1序列最相似的基因，也在拟南芥中控制胚胎发育[30]。在胡萝卜中，C-lec1被证明是一个lec1同源基因，并在胚胎发育发挥类似的作用[29]。其他的NF-YB亚基蛋白，不属于LEC1类，已被证明是一种新的基因调控子，参与叶绿体发育和干旱反应的重要调节[28-29]。

水稻（OsHAP3A-C）的三个亚基在植物体内普遍表达。抑制水稻hap3基因的表达导致叶绿体退化和光合作用途径的基因下调表达，说明水稻hap3基因参与叶绿体的发育。目前，从反义RNA和RNAi试验数据表明：在水稻中NF-YB一些亚基被推断为参与叶绿体的功能形成。水稻hap3a基因和同源基因水稻hap3b、水稻hap3c显示出了控制叶绿体的生物合成[17]。提出每个hap3基因具有专一的作用。相比之下，在植物中，hap2和hap5基因都没有被深入地研究。有研究分析表明，三聚体HAP复合体在植物中组合成了CCAAT的结合识别序列[30-32]。

2.3 核因子Y在植物光合作用中的调节作用

最近，有证据显示植物的所有三种NF-Y家族亚基成员活动的变化会影响开花时间。拟南芥NF-Y家族的NF-YB2（HAP3b）和密切相关的拟南芥蛋白NF-YB3（HAP3c）有着相似的功能，二者在开花诱导上都是必需的[33]。在光周期诱导的条件下，NF-Y复合体提供了DNA结构，能和CONSTANS蛋白结合，激活光周期途径促进开花的重要下游组件转录促进开花，例如FT基因。进一步通过使用一个ELISA法为基础的体外试验表明，植物的NF-YB亚基能够结合CCAAT盒启动子元件并作为NF-YA（HAP2）和NF-YC（HAP5）三聚体亚基的一个特殊结构。越来越多的证据表明CCAAT框结合的核因子Y家族在调控开花时间中起作用。特别是NF-YB2亚基（HAP3b）已被证明通过促进开花的CO2（SOC1）表达（FT）[34-35]。虽然没有试验证据表明，CO有DNA结合活性，但CO及相关蛋白最近能够在体外和体内研究，已显示出能结合NF-YB和NF-YC亚基蛋白的特性，包括核因子-YB2系列[36-37]。因此，有可能NF-YB调节植物开花的影响，可以作为NF-Y复合体的一部分来直接与CONSTANS蛋白质相互作用。长日照条件下表型变化很明显，并暗示了NF-YB2与CONSTANS的蛋白质在同一途径相互作用，通过“光周期途径”调节开花，并反对“自主”开花途径[38]。

核因子Y家族的CCAAT盒结合蛋白在植物中实现了很多种NF-Y三聚体的组合，以一种正调控或者负调控的方式，任意数量的三聚体都可能影响开花时间。特别值得注意的是，另一种拟南芥的NF-YB亚家族的HAP3a（NF-YB1）成员，最近被证明抑制开花[37]。因此，NF-YB1可能在NF-YB2和NF-YB3促进开花上起到相反的作用。

鉴定NF-YA（HAP2）、NF-YC（HAP5）与NF-YB（HAP3）蛋白质，以及对于目标基因的结合位点，现在是一个具有挑战性的任务，需要广泛的遗传与生物学的研究，所以提出DNA结合生化方法检测。这很可能是具体的核因子Y的亚基和目标基因的结合来监管调控开花时间。如CO在特定的环境或生理条件下，将提供优良的光周期条件调控开花。除了植物核因子Y蛋白质在开花时间调控中的作用，这个家族已演变为一种调节植物生物学的重要方面，包括胚胎发育，光合作用和生理反应调节[29-30]。通过他们与其他调节蛋白互作，如CCTs，以及可能的大量亚基组合，核因子-Y家庭的DNA结合蛋白提供了许多关键的共同协调途径。

3 植物核因子Y的研究方法

随着植物功能基因不断地深入研究，用来研究植物基因功能的方法也随之增多，目前研究植物核因子Y功能的方法主要包括以下几种。

3.1 瞬间表达分析方法

该方法是指植物转录因子瞬间表达分析，主要是针对转录因子与特定顺式作用元件的结合及对其转录的激活或转录抑制效应的作用[39]。辣椒WRKY转录因子基因的瞬间表达分析，就是通过基因枪瞬间转化技术将两种载体共转化洋葱表皮细胞。检测共转化洋葱表皮细胞中gus基因的表达情况，以此来分析转录因子与其特定的顺式元件结合的作用及对其转录的激活效应。目前用得比较多的基因瞬间表达分析方法有酵母单杂交和酵母双杂交。

3.2 植物基因功能突变分析方法

该方法包括基因功能的缺失突变和基因功能获得性突变两个方面，目前，基因功能的缺失突变研究方法主要包括T-DNA插入突变[40]、反义抑制、转座子插入突变[41]。植物转录因子基因功能获得性突变主要有基因超量表达和基因诱导表达两种。

3.2.1 植物转录因子基因超量表达

该方法是指将转录因子基因全长序列与组成型强启动子（花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子）融合，转化受体材料，获得目标基因产物过量表达的植株。超量表达拟南芥nf-yb1的转基因植株在抗旱胁迫反应中较野生型植株表现明显，而T-DNA插入突变的拟南芥nf-yb1的转基因植株在抗旱胁迫中的反应表现不明显。叶片明显萎蔫，发黄[20]。拟南芥nf-ya5基因在干旱条件下，是个上调表达基因。对miR169前体物miR169a和miR169c的表达分析显示：在干旱情况下，miR169a和miR169c下调表达。拟南芥nf-ya5包含有miR169结合位点，与目标mRNA结合抑制基因的转录。在依赖于ABA的干旱胁迫途经下，miR16下调表达。拟南芥nf-ya5基因敲除植株和miR16a基因敲除植株显示了叶片严重失水，转基因植株比野生型植株更敏感。相比之下，过量表达拟南芥nf-ya5基因植株比野生型植株对干旱反应不是很敏感，表现叶片失水减少，野生型植株叶片失水严重，出现萎蔫和发黄状态。基因芯片分析表明，拟南芥nf-ya5是干旱反应的至关重要表达的数量基因。因此，拟南芥nf-ya5抗旱能力是很重要的，其诱导干旱胁迫都发生在转录和逆境的水平[14]。但该方法得到的目标基因产物的超量表达往往是致死效应，从而很难从表型上正确判断和评价目标基因对植株的真实影响，因而这种方法具有很大的局限性[42]。

3.2.2 植物转录因子基因诱导表达

植物转录因子基因诱导表达可以实现基因表达的时间控制，可以避免如基因超量表达引起的致死效应和多重效应的局限，因而可以成为基因功能获得性研究中一种非常有效的方法。利用热击蛋白的表达特性是最先出现的基因诱导表达系统。在热击的情况下，热击蛋白的启动子会启动其下游基因序列的表达，将目标基因与该启动子相结合，在热击的情况下即可以实现对目标基因的时空表达的控制，即所谓的HS（Heat-shocking）系统[43]。之后又建立起其他的诱导表达系统，又如依赖于四环素的tTA表达系统，四环素反式激活蛋白（tTA）是一个包含大肠杆菌TN10（编码四环素的抑制子）和单纯疱疹病毒P16蛋白（VP16）C端部分的融合蛋白，它能够促进由7个tet操纵子和一个TATA-box组成的人工启动子控制的报告基因（如gus基因）的转录，在四环素及其衍生物的条件下，四环素能够干扰tTA与操纵子DNA的结合。tTA无法与其靶位点相互作用，从而极大地减少报告基因的表达，转录也就无法进行。四环素这种严谨的表达调控诱导系统在细胞水平和转基因中被广泛用来研究基因的功能。这一系统可用于对那些可能产生致死产物的基因进行转基因研究[44]。如依赖于铜离子的表达系统，这是一种根据酵母MT（Metallothionein，金属硫）基因的调控原理构建的应用于植物的基因表达系统。该系统中铜离子的浓度直接作用于组合式启动子的活性，因此可以用于基因的适时精确表达实验中。目前，已经有大量的实验表明：这些诱导系统中，用得最多的是GR系统，可以成功地应用于研究植物（双子叶植物和单子叶植）转录因子的功能。

3.3 基于糖皮质激素受体系统的基因诱导表达

糖皮质激素受体系统（GR）的基因诱导表达，已经被证实是研究基因功能和植物转录因子非常有效的诱导表达系统。它利用了GR的调控机制，即在没有配基（如DEX，地塞米松）的情况下，GR的配基结合功能区与其相连的蛋白分子相结合，从而封闭该GR的配基蛋白分子的结合，其功能就会失去；但在有GR的配基存在的条件下，其功能又可以恢复[45]。

3.4 RNA干涉（RNAi）

近几年发展起来的RNAi技术，作为一种高效、特异的代替基因敲除的遗传工具，此技术正在加速改变着功能基因组学领域的研究[46]。

4 结语

核因子Y功能多样，它们参与调节植物生物学的重要方面，包括胚胎发育、光合作用、叶绿体发育和干旱反应等重要生理过程。目前，在数量众多的NF-Y转录因子中，功能明确的只占很少一部分，大部分NF-Y转录因子的研究尚处于基因克隆、结构鉴定和表达分析等层面上。对于植物核因子Y复合物的生物学功能，人们了解的还不是很清晰。NF-Y转录因子的下游目标基因和上游调控因子更是知之甚少。但是，相信随着RNAi、反义RNA等技术和miRNA的不断发展和应用以及NF-Y蛋白同DNA与其他蛋白相互作用的深入研究，将会进一步明确NF-Y转录因子的生物学功能，其调控网络也会逐渐清晰。

*感谢农业部大豆产业科技研发中心和黑龙江省教育厅创新团队对本试验的支持。

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