黄 勇，张 铁，张文生，辛文锋

（1.文山学院 生化系，云南 文山 663000；2.北京师范大学，北京 100875；3.云南省三七生物技术与制药工程研究中心文山分中心，云南 文山 663000）

三七 [Panax notoginseng（Burk）F.H.Chen]又名田七，系五加科人参属植物，享有“金不换”、“南国神草”、“人参之王”等美誉，是我国传统名贵中药材。三七味甘、微苦、性温，具有防治癌症、抗衰老、抗疲劳、抗炎、降血压、降血脂等多方面的药理作用和保健功能，其主要药理活性成分是皂苷，目前尚不能人工合成。三七对生长条件要求苛刻，全世界仅云南省文山州以及广西部分地区适宜生长，加之生长周期长、病虫害严重、连作障碍、农药残留等问题，市场上三七资源供不应求。通过组织培养技术，既可快速繁殖三七种苗，又可直接生产次生代谢物，是有效解决上述问题的途径之一。本文将对国内外三七组织培养研究进展做一综述。

1 愈伤组织诱导

在三七组织培养过程中，不管是进行种苗快速繁殖，还是次生代谢物生产，愈伤组织的诱导是首要的重要步骤，在愈伤组织诱导中，外植体的选择、激素的种类组合与浓度关系着组织培养效果的好坏甚至成败。

1.1 外植体选择

由于细胞具有全能性，故三七各器官均能诱导出愈伤组织，但诱导率差异甚大。因此，筛选出愈伤组织诱导率高的器官作为三七组织培养的外植体至关重要。郑光植等[1]研究表明：无论生长速率和干重增加、粗皂苷含量和产率、粗皂苷元含量、主要皂苷成分Rg1、Rb1和Rh1及其含量、皂苷组成还是诱导愈伤组织的频率及速率，都以茎作为外植体诱导的愈伤组织更为优良。高先富等[2]认为幼嫩花蕾愈伤组织是诱导不定根的理想材料。段承俐[3]用花药作为外植体诱导愈伤组织，取得了较好的效果。由此可见：三七愈伤组织取材广泛，可根据研究目的选用不同的外植体。一般情况下选用茎作为外植体会取得不错的效果；用幼嫩花蕾作为外植体有利于不定根的诱导；从事单倍体方面的研究则应选用花药作为外植体。

1.2 激素选择

植物生长调节剂又称植物激素，包括细胞分裂素、生长素等。细胞分裂素和生长素搭配使用可诱导植物脱分化形成愈伤组织，被广泛应用于植物组织培养。但不同的植物对植物生长调节剂的种类和浓度的反应不尽相同。因此，需要筛选出适合三七愈伤组织诱导的激素组合与浓度。目前，在三七组织培养中，用于愈伤组织诱导的生长素大多使用2，4-D，浓度一般为2 mg·L-1左右；搭配使用一定浓度的细胞分裂素效果更佳，目前大多使用KT，浓度一般为 0.5～0.7 mg·L-1[1-2，4]。

1.3 基本培养基选择

目前，三七组织培养中，用于愈伤组织诱导的基本培养基主要是MS培养基[1-4]。也有少数研究使用 6，7V[5]。

1.4 培养条件

三七愈伤组织诱导一般是在黑暗条件下进行，光照有一定抑制作用[4-6]，温度和pH值一般分别为25 ℃和 5.8[1，5，7]。

2 次生代谢物生产

三七与其下游产品的药效成分主要集中在皂苷，通过组织培养技术可以实现皂苷规模化生产。用植物悬浮细胞培养技术生产次生代谢物质已成为当代生物制药的一个重要领域；通过诱导愈伤组织、筛选培养条件、选择优良培养体系和添加合适诱导物质等方法，可以进行细胞原的批量生产，然后分离提取得到代谢产物。这种生产方式得到的次生化合物含量往往比植物体高出2～5倍，而且细胞悬浮培养生产次生代谢物质具有不受各种外界环境的影响、繁殖速度快、培养规模大和提供大量均匀一致植物培养物等优点，适于大规模的工厂化生产。

日本、韩国通过细胞培养、不定根培养已实现了人参皂苷的工厂化生产。而三七在这方面的研究起步较晚，郑光植等[1，4，6]进行了较为系统的研究，对外植体类型、培养基、培养条件、外源激素、培养基天然补充物等影响因子进行了研究，使三七愈伤组织的生长速率达220 mg·L-1·D-1，愈伤组织中总皂苷含量达13%。侯篙生等[8]用5 L气升式反应器培养细胞，发现外循环反应器中三七总皂苷含量达9.48%；内循环反应器中三七多糖含量达24%，但三七细胞生长比较缓慢。周立刚等[9]（1992）用10 L的搅拌式发酵罐对三七细胞进行发酵培养，皂苷含量为干重的11.21%，皂苷产率为1513.3 mg·L-1，细胞培养物产率为每月13.58 g干重·L-1，均比悬浮培养高。甘烦远等[10]研究了人参寡糖素对三七悬浮培养细胞生长的效应，发现人参寡糖素对三七悬浮培养细胞的生长具有明显的促进作用。

3 不定根与不定芽诱导

根据研究目的的不同，可通过调节培养基中细胞分裂素和生长素的种类和浓度，诱导愈伤组织产生不定根或者不定芽。如果是为了生产次生代谢物，则诱导不定根，进而对不定根进行继代增殖培养，扩增出大量不定根后从中提取皂苷等次生代谢物；如果是为了获得组培苗，则诱导不定芽，继而诱导生根，从而形成完整的组培苗用于栽培或其它研究。

3.1 不定根诱导

人参不定根培养已成功实现了工业化，反应器规模达到10000 kg[11]，而三七在这方面处于起步阶段。高先富等[2]研究表明：幼嫩花蕾愈伤组织是诱导不定根的理想材料；IBA诱导不定根的能力最强；采用将不定根连其母体组织一起在液体培养系统中连续培养后再分离的方法较好。淡墨[12]研究了茉莉酸甲酯对三七不定根次生代谢产物的影响，表明茉莉酸甲酯刺激后三七不定根的次生代谢产物与天然三七根更为相似，证明茉莉酸甲酯可以作为三七不定根增加活性次生代谢产物合成的有价值的诱导剂，值得进一步研究。在建立了三七不定根培养体系的基础上，可用生物反应器进行放大培养，并优化培养条件，最终实现皂苷的工业化生产。

3.2 不定芽诱导与组培苗

刘瑞驹等[13]首次报道了三七胚状体的发生，并成功诱导出不定芽进而形成完整植株。陈伟荣等[7]对三七试管苗进行了详细的研究，获得了大量组培苗。许鸿源等[14-15]使用灵发素诱导茎愈伤组织产生胚状体取得了较好效果，胚状体诱导率达90%左右，且约有30%以上的胚状体能发育成健壮的全苗，用三七叶片作为外植体也取得了与此相当的效果。由此可见：通过诱导愈伤组织产生胚状体进而分化不定芽可得到三七组培苗，但畸形胚和不完整胚较多、成苗率低。如何获得更多正常的胚状体、提高成苗率是需要继续研究的内容。

4 讨论

在三七组织培养领域，由于起步较晚，各项技术还不是很成熟，要得到高皂苷含量和快速生长的愈伤组织，并将其用于细胞培养、不定根培养，实现皂苷生产的工业化，还需要深入研究。如何提高组培苗的成苗率，实现三七种苗的离体快繁也具有重要的研究价值，产生经济效益。毛状根具有可以在无激素的培养基上快速生长、拥有亲本植物的次生代谢途径、遗传稳定、生长迅速等特点，人参、西洋参毛状根培养技术已比较成熟[16-17]，而三七还未开展毛状根培养的研究，筛选适宜的发根农杆菌诱导三七产生毛状根可能是以后研究的热点。

［1］郑光植，王世林，甘烦远，等.三七组织培养的建立［J］.生物工程学报，1989（1）：64-69.

［2］高先富，徐朝晖，刘佳健，等.三七不定根的离体诱导与培养［J］.中国中药杂志，2006 （31）：1485-1488.

［3］段承俐，张智慧，文国松，等.三七花药培养的研究（Ⅰ）愈伤组织的诱导［J］.云南农业大学学报，2004 （5）：510-513.

［4］郑光植，梁峥.三七的组织培养［J］.植物学报，1978 （4）：373-375.

［5］郭枫，王爱琴，胡之璧，等.三七的组织和细胞培养（简报） ［J］.植物生理学通讯，1992 （1）：45-47.

［6］郑光植，王世林.三七愈伤组织的培养［J］.云南植物研究，1989 （3）：255-262.

［7］陈伟荣，简玉瑜.三七试管苗繁殖技术的研究［J］.华南农业大学学报，1992 （3）：69-75.

［8］侯篙生，陈士云，卢大炎，等.三七细胞在气升式反应器中的扩大培养研究［J］.武汉植物学研究，1991（4）：387-390.

［9］周立刚，郑光植，王世林，等.三七细胞大量（发酵）培养的研究［J］.植物学报，1992 （1）：76-80.

［10］甘烦远，郑光植.人参寡糖素对三七悬浮培养细胞生长的效应［J］.广西植物， 1994 （1）：70-73.

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［12］淡墨.应用代谢组学策略研究茉莉酸甲酯对三七不定根次生代谢产物的影响［D］.上海交通大学，2008.

［13］刘瑞驹，蒙爱东，李春霞，等.三七的胚状体发生和植株再生［J］.植物生理学通讯， 1991 （3）：210.

［14］许鸿源，蒙爱东，李春霞，等.灵发素对三七胚状体发生及其成苗的影响［J］.中药材，2004 （10）：711-712.

［15］许鸿源，蒙爱东，何冰，等.三七叶器官获得胚状体和再生植株的研究［J］.中国中药杂志，2007 （6）：481-483.

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