邓 杰 王 辉 程 锋 武 剑 王晓武

（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，农业部蔬菜遗传与生理重点开放实验室，中-荷联合园艺作物基因组技术实验室，北京 100081）

白菜类蔬菜是十字花科（Cruciferae）芸薹属（Brassica）芸薹种（B.campestrisL.）中的栽培亚种群。它包含白菜亚种〔ssp.chinensis（L.）Makino〕、大白菜亚种〔ssp.pekinensis（Lour）Olsson〕、芜菁亚种（ssp.rapiferaMetzg）。随着栽培历史的发展，在这些亚种中又有变种、类型及其品种的逐渐分化，已成为我国栽培蔬菜中庞大的亚种、变种及其品种的群体。

叶部是白菜类作物的主要食用部位，也是影响其产量和品质的重要指标之一。对白菜类作物叶片性状的深入研究对提高其产量和选择不同叶片表型的育种材料具有重要的意义。目前，对白菜类作物的QTL 研究主要集中在抗病性（Matsumoto et al.，1998；卢钢 等，2002）、抗逆性和抽薹开花（Axelsson et al.，2001；Kole et al.，2002；于拴仓 等，2004）等方面，专门针对叶部形态学进行QTL 定位的研究工作还较少。本试验利用两个白菜类作物DH 群体和已构建的遗传连锁图谱，针对叶长、叶宽及叶片形态指数性状进行QTL 定位和分析，这将为白菜类作物分子标记辅助育种起到积极的推动作用。

1 材料与方法

1.1 DH 群体和遗传连锁图谱

本试验使用2 个DH 亲本Z16〔大白菜，Brassica campestrisL.ssp.pekinensis（Lour）Olsson〕和L143（白菜型油菜，Brassica campestrisL.var.yellow sarsonPrain）及1 个多代自交亲本苏州青〔普通白菜，BrassicacampestrisL.ssp.chinensis（L.）Makino var.communisTsen et Lee〕构建了2 个各含有120 个株系的DH 群体：Z16_L143 BC2DH 和Z16_SZQ F1DH。用于构建群体的亲本间在叶片形态方面存在显著差异。利用已构建的上述2 个群体分别具有143、230 个InDel 标记的遗传连锁图谱对叶片形态学性状进行QTL 分析。

1.2 群体种植和性状调查

由于供试群体存在易抽薹的现象，将Z16_SZQ F1DH 群体于2011年5月播种于纱棚中，Z16_L143 BC2DH 群体于2011年10月播种于温室中，上述试验均在中国农业科学院蔬菜花卉研究所进行。群体内每株系3 次重复，常规栽培管理。播种后约60 d 在株系抽薹开花之前选取自外层起第5 片或第6 片完整无缺损的叶片，进行拍照并扫描，利用+LA-S 全能型植物图像分析系统测量叶长（LL）、叶宽（LW），计算叶片形态指数（LW/LL）。性状测量的具体标准参照李威等（2009）的方法。

1.3 数据统计和QTL 分析

基于本实验室已构建的两个DH 群体的分子遗传图谱，用MAPQTL 4.0 软件进行叶片形态学性状的QTL 分析。形态学性状数据以3 次重复的平均值进行QTL 分析。首先利用置换测验做1 000 次重复，估算基因组范围内α=0.05 水平上的LOD 阈值。在本试验中，根据每个性状每条连锁群Permutation test 检测到的95%置信区间的LOD 值作为阈值。利用区间作图法（IM）进行QTL 分析，在每条染色体上每隔1 cM 对QTL 存在的可能性扫描1 次。对于IM 分析检测到的QTL，将最高LOD 值所在位置的标记或与其紧密连锁的标记作为协同因子，对IM 检测到的QTL 进行多座位QTL 模型（MQM）检测。以连锁群上LOD 值最高的位置作为QTL 的位置（van Ooijen，1992）。

1.4 白菜类作物自然群体中候选基因表达量与叶片形态指数关联分析

利用包括大白菜、普通白菜、芜菁、乌塌菜、菜薹等95 份不同材料组成的白菜类作物自然群体（表1），提取植株5～6 片真叶时期莲座叶叶片的总RNA，进行转录组测序。该数据用于分析植株莲座期可能候选基因表达量与叶片形态指数之间的相关性。

表1 白菜类作物自然群体中表达谱测序的95 份材料

1.5 候选基因序列分析

BrXTH9基因序列来源于大白菜基因组计划公布的全基因组序列及白菜注释基因数据库（http://brassicadb.org/brad/），信号肽剪接位点的预测通过SignalP 软件完成（Nielsen et al.，1997）。文中引用的其他物种XTH家族基因均来源于NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov），序列比对通过Clustal W 软件完成（Altschul et al.，1990）。

2 结果与分析

2.1 亲本间叶部形态学性状的差异以及在DH 群体中的变异

由图1 可知，亲本Z16 叶片形态指数（LW/LL）较大，表现为较为宽扁的表型（图1-A）；SZQ及L143 叶片形态指数较小，表现为较为细长的叶片表型（图1-B、C），亲本之间存在着显著差异。在Z16_SZQ F1DH 及Z16_L143 BC2DH 群体中，叶片形态指数性状分离明显（图1-D～O）。

由表2、3 可知，构建DH 群体的亲本之间叶柄长、叶片长及叶片形态指数性状经过t检测，存在显著的差异。因而用该群体检测可能获得控制叶片相关性状的QTL。

图1 亲本叶片形态指数表型及在DH 群体中的分离情况

表2 Z16_L143 BC2 DH 群体亲本叶部形态学性状及在DH 群体中的分布

表3 Z16_SZQ F1 DH 群体亲本叶部形态学性状及在DH 群体中的分布

2.2 叶部形态学性状的QTL 定位及基因效应分析

利用已构建的分子遗传图谱，采用多座位QTL 模型对白菜类作物叶部形态学性状进行QTL分析。两个DH 群体中，在6 个连锁群上共检测到9 个QTLs 位点。其中6 个QTLs 与叶长相关，2 个QTLs 与叶片形态指数相关，1 个QTL 与叶宽相关。这些QTLs 分别位于A01、A03、A05、A06、A09 和A10 上（表4，图2、3）。

控制叶长的QTL 在Z16_SZQ F1DH 群体中共检测到3 个，分别命名为LL-1、LL-2 和LL-3，分别位于A01、A06 与A09 连锁群上。3 个QTLs 解释的遗传贡献率在7.1%～13.4%之间，其中LL-3 的遗传贡献率最小，LL-1 为减效位点，LL-2 和LL-3 为增效位点（表4）。这3 个QTLs 解释的总变异为29.0%。

表4 叶部形态学性状的QTL定位及其基因效应

图2 叶部形态学性状QTL在Z16_SZQ F1 DH 群体分子遗传图上的分布

图3 叶部形态学性状QTL在Z16_L143 BC2 DH 群体分子遗传图上的分布

同时在Z16_L143 BC2DH 群体中也检测到3 个控制叶长的QTLs，分别命名为LL-4、LL-5 和LL-6，分别位于A03、A09 与A10 连锁群上。这3 个QTLs 解释的遗传贡献率在8.4%～12.8%之间，且全部是增效位点，可解释的总变异为32.3%（表4）。两个群体中都在 A09 连锁群上检测到 1 个控制叶长的QTL：LL-3 与LL-5。将这2 个QTLs 两侧标记引物序列分别与大白菜基因组序列（http://brassicadb.org/brad/）比对，结果表明BrID10549 和BrID10541 的位置相近且都位于Scaffold000006 上。

图4 叶片形态指数QTL在Z16_SZQ F1 DH 群体A03 连锁群上的分布

控制叶片形态指数（LW/LL）的QTL 在两个群体中分别各检测到1 个，都位于A03 连锁群上。将在Z16_SZQ F1DH 群体中检测到控制叶片形态指数的QTL 命名为LW/LL-1，可解释的遗传贡献率为 28.1%，在 Z16_L143 BC2DH 中检测到控制叶片形态指数的 QTL 命名为LW/LL-2，可解释的遗传贡献率为15.7%。根据大白菜基因组计划公布的全基因组序列及亲本Z16 与苏州青的重测序结果，设计InDel 标记，在Z16_SZQ F1DH 群体中对检测到的控制叶片形态指数的QTL 区域进行标记加密。结果表明在BrID111431 位点处检测到1 个较为显著的QTL，其LOD 值为6.47，可解释22.7%的表型变异（图4）。将在标记加密后的Z16_SZQ F1DH 群体及Z16_L143 BC2DH 群体中A03 连锁群上检测到的叶片形态指数相关的QTL 侧翼标记引物序列与大白菜基因组序列比对分析发现，BrID10459 位于Scaffold000001 上5388767 位点处，BrID10155位于Scaffold000005 上1335769 位点处，BrID111431 位于Scaffold000001 上4719555 位点处，表明两个群体中A03 连锁群上检测到的叶片形态指数相关的QTL 位于染色体上相近的位置。

控制叶宽的QTL 只在Z16_L143 BC2DH 群体中检测到1 个，命名为LW-1，位于A05 连锁群上。这个QTL 解释的遗传贡献率为15.6%，为减效位点，效应值为-10.88。

2.3 叶片形态指数候选基因分析

对Z16_SZQ F1DH 群体中检测到的叶片形态指数A03 连锁群上QTL 位点处标记BrID111431的带型与叶片形态指数表型性状进行对应分析，结果表明（图5），叶片形态指数最小的10 个株系其带型均为b，表明这些株系在该标记处的等位基因来源于亲本SZQ；而叶片形态指数最大的10 个株系在BrID111431 位点处的带型均为a，表明这些株系在该位点的等位基因均来源于Z16。上述结果表明在标记BrID111431 位点处，来源于Z16 的等位基因会导致叶片形态指数变大，而来源于SZQ 的等位基因会导致叶片形态植株变小。

图5 Z16_SZQ F1 DH 群体中叶片形态指数最大与最小的10 个株系及其带型

通过白菜注释基因数据库（http://brassicadb.org/brad/）找到BrID111431 标记上下游注释基因进行分析。结果表明（表5），该标记上下游的各5 个注释基因与拟南芥的注释基因均具有线性关系，包括细胞壁松弛与重排的基因（Bra000840）、与激素Aux/IAA 蛋白结合的基因（Bra000842）、WD40 家族成员基因（Bra000849）、两个功能未知的基因（Bra000841、Bra000854）等。

将BrID111431 上下游各5 个注释基因的物理位置锚定到A03 连锁群上Scaffold000001（图6），分别位于该标记上下游各54 Kb、24 Kb 的区域内。

利用95 份白菜类作物构成的自然群体表达谱数据检测结果，通过SPSS 软件对检测到的控制叶片形态指数QTL 位点：标记BrID111431 上下游各5 个基因的表达量与田间单株测量的叶片形态指数进行了相关性分析。结果表明（表6），有3 个白菜注释基因的表达量与叶片形态指数表现出极显著的相关性，分别为Bra000840、Bra000846、Bra000847。Bra000847表达量与叶片形态指数的相关系数最高，为0.439。该基因是拟南芥AT4G03070的同源基因，在拟南芥中参与到硫苷合成的相关途径中（Kliebenstein et al.，2001），该基因突变或过表达并不能引起拟南芥叶片表型的突变。Bra000846是拟南芥AT4G03080的直系同源基因，对BRI1基因有抑制作用，具有丝氨酸/苏氨酸磷酸化作用，该基因的突变体也不能引起拟南芥叶片表型变异。注释基因Bra000840为拟南芥中AtXTH9（AT4G03210）的直系同源基因，属于XTH基因家族的成员。该基因在细胞的伸长及细胞体积膨大过程中起着十分重要的作用。XTH家族在催化细胞壁形态改变的过程中主要有两个步骤：首先内切木葡聚糖分子，再次将产生的木葡聚糖分子一端连接到另一个木葡聚糖分子的非还原端，从而对细胞的延展性进行调节。Shin 等（2006）研究表明从白菜类作物中克隆的AtTXTH9的直系同源基因BcXTH1转化到拟南芥中过表达会导致莲座期叶片特异性变宽、叶片形态指数变大，生殖生长时期的花茎等器官特异性变长。本试验中检测到的叶片形态指数相关的QTL 定位在标记BrID111431 位点上，该标记距离BrXTH9基因约54 Kb，为AtXTH9与BcXTH1的直系同源基因，而BrID111431 附近的其他基因在拟南芥突变体库中并没有发现会引起表型的变化报道（http://www.arabidopsis.org/），同时BrXTH9在95份白菜类作物自然群体中的表达谱数据与叶片形态指数具有极显著的相关性，该基因表达量增大会伴随着群体中叶片形态指数变大的趋势，因而将BrXTH9基因作为可能控制叶片形态指数的候选基因。

表5 白菜类作物中叶片形态指数A03 连锁群上QTL区域注释基因

图6 白菜类作物中BrID111431 上下游各5 个基因及其物理位置

表6 白菜类作物自然群体中BrID111431 上下游10 个注释基因表达量与叶片形态指数相关性

2.4 BrXTH9 序列分析

BrXTH9是从亲本Z16 与SZQ 的cDNA 克隆出来的，测序表明该基因序列全长为873 bp，共编码290 个氨基酸（图7），两亲本之间该基因的编码产物无差异。BrXTH9与拟南芥中直系同源基因AtXTH9在核酸水平上的相似性为 88.1%，利用 SignalP 软件（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）对BrXTH9氨基酸序列进行信号肽预测，结果表明在N-末端有1 个可能存在的信号肽，表明BrXTH9编码产物可能是分泌蛋白。利用N-X-T/S 模型对BrXTH9编码氨基酸的N-末端糖基化位点进行预测，结果表明氨基酸序列中Asn54和Asn108为可能存在的糖基化位点（图7）。XTH基因保守的结构域（DEIDFEFLG）在BrXTH9编码氨基酸中位于98～107位点，并存在两个氨基酸（NEF DFEFLG）的突变。

图7 BrXTH9 序列分析

2.5 白菜类作物中BrXTH 基因家族进化分析

至今，在拟南芥中共发现33 个XTH基因家族成员，AtXTH1-AtXTH33。而在白菜类作物中只报道了AtXTH9的直系同源基因BcXTH1，其他XTH基因家族成员仍没有相关的报道。在本试验中，以大白菜基因组计划公布的白菜全基因组序列及注释基因数据库（http://brassicadb.org/brad/），在大白菜中共找到了39 个BrXTH基因家族成员（图8）。拟南芥33 个XTH家族成员中的4 个XTH基因（AtXTH1、AtXTH2、AtXTH20、AtXTH24）在大白菜中没有找到直系同源基因。大白菜中不同拷贝之间的亲缘关系更近。

确定的大白菜中控制叶片形态指数可能的候选基因BrXTH9与拟南芥AtXTH9为直系同源基因，该基因在大白菜中有两个拷贝（图8），AtXTH9可分为独立的分支。同时发现，XTHs在大白菜中存在个拷贝现象，这可能是拟南芥属与芸薹属在进化过程中分化后大白菜基因组加倍所造成的。

图8 XTH 基因家族进化分析

3 结论与讨论

叶片大小直接关系到白菜类作物的产量和品质，而叶片形态指数又与外观品质紧密相关，对这些性状的QTL 分析及主效位点的确定，将为白菜类作物品质改良育种提供依据。本试验在Z16_SZQ F1DH 及Z16_L143 BC2DH 两个群体中研究了叶长、叶宽及叶片形态指数3 个性状。结果表明，两个群体中都在连锁群A03 Scaffold000001 上相近的区域检测到1 个控制叶片形态指数的QTL，在连锁群A09 上都检测到1 个控制叶长的QTL，但只在1 个群体中检测到针对叶宽的QTL，可能是该性状易受到环境或其他生理条件的影响。

Lou 等（2007）利用L143 与PC-175 构建的71 个株系的DH 群体将叶长、叶宽及叶片形态指数3 个性状定位在连锁群A02、A03、A06 和A09 上，本试验同样在连锁群A03 上定位到了叶片形态指数的QTL。李威等（2009）利用大白菜材料构建的DH 群体对叶长与叶宽等性状进行了QTL 分析，在4 条连锁群上共获得了12 个相关的QTLs，其中在连锁群A09 上同样检测到1 个与叶长相关的QTL。

通过分析Z16_SZQ F1DH 群体中检测到的控制叶片形态指数的QTL 区域，将该QTL 区域中大白菜与拟南芥注释基因进行比对，发现大白菜基因组中在该区域存在拟南芥AtXTH9（Hyodo et al.，2003）的直系同源基因，有研究表明白菜型油菜中AtXTH9的直系同源基因BcXTH1与叶片的大小形态相关，该基因过表达会导致莲座期叶片特异性变宽，叶片形态指数增大（Shin et al.，2006）。本试验中利用95 份白菜类作物的自然群体对该基因的表达量与叶片形态指数相关性分析，发现两者之间存在极显著相关性，BrXTH9基因表达量高，则叶片形态指数有变大的趋势。在拟南芥中，AtXTH9编码产物葡聚糖水解酶蛋白参与细胞壁的松弛与重排并促进细胞的伸长（Rose et al.，2002），但其具体功能还有待于进一步研究。

利用大白菜全基因组信息，本试验分析了大白菜中XTH家族成员的进化关系，相对于拟南芥33 个XTH家族中的29 个成员，在大白菜中共鉴定出了39 个直系同源基因。通过比对分析表明BrXTH9与AtXTH9在核酸水平存在很高的序列相似性。拟南芥中XTH成员编码的氨基酸序列存在1 个高度保守的结构域（DEI DFEFLG），但是Hyodo 等（2003）研究表明XTH9存在两个氨基酸的替换（NEF DFEFLG），本试验结果也发现了同样的突变位点。这表明BrXTH9可能与AtXTH9及BcXTH1存在同样的作用机制。

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