张吉仲，万 谦，刘 圆

(1.西南民族大学民族药物研究院，四川成都 610041;2.成都中医药大学第二临床医学院，四川成都 610041)

白花丹是指蓝雪科植物白花丹Plumbago zeylanica L.的干燥根、根茎及全草，是东南亚多个国家及其中国常用药材。在我国，其主要生长于四川、福建、广西、广东等地区，主要具有祛风散瘀、解毒杀虫、消肿止痛等作用［1－2］。白花丹醌(plumbagin)为白花丹的主要活性成分［3］，经检验其具有广泛的药理作用，如抗炎、抗凝等。

目前有细胞实验表明:白花丹醌对卵巢癌［4］、乳腺癌［5］、胃肠道肿瘤［6］等具有一定的抗肿瘤活性。肝癌为一种人类常见的高度恶性肿瘤，其浸润和转移能力强，预后差。

本研究旨在通过体外实验检测白花丹醌对人肝癌细胞HepG2和SMMC-7721生长的影响机制，以期研究其对肝癌细胞的抗肿瘤活性。

1 材料

1.1 实验细胞 HepG2、SMMC-7721，购买自四川大学法医与基础医学院生物化学与分子生物学研究所。

1.2 主要药物及试剂 白花丹醌(本实验室制备，纯度 98%);3-(4，5-Dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide(MTT):Sigma，M2003，美国;RNA提取试剂盒:MRC，Tri Reagent，美国; DEPC:BBI，加拿大;cDNA合成试剂盒:MBI，RevertAidTMH Minus First Strand cDNA Synthesis kit，立陶宛;荧光定量PCR试剂盒(Qpcr):Roche，Faststart U-niversal SyBr Green Master(Rox)，瑞士。

引物合成:从NCBI网站查得Bax、Bcl-2、Cyclin D1和β-actin的全基因序列;利用软件Primer Express 3.0设计引物，设计时扩增长度选定130 bp，其余参数选为默认值。各基因的引物序列如Tab 1。

Tab 1 The primer sequences of the detected genes in Qpcr analysis

1.3 主要仪器 细胞培养箱:Thermo Scientific，Forma Series II Water Jacket，美国;台式高速冷冻离心机:Thermo Scientific，Micro 17R，美国;酶标仪: Thermo Scientific，Multiskan Spectrum，美国;DNA Engine PCR仪:MJ Research，PTC-200，美国;实时荧光定量PCR仪:Bio-Rad，CFX96型，美国;倒置相差显微镜:Leica公司，DMI3000B，德国。

2 方法

2.1 检测白花丹醌对HepG2和SMMC-7721细胞的半数抑制率(IC50) 以DMSO为溶剂，无菌条件下配制白花丹醌原始溶液，浓度为4.57 g·L－1。分别接种生长良好HepG2、SMMC-7721细胞至96孔板，接种细胞量为1.5×104/孔，接种体积为180 μl/孔，5%CO2，37℃条件中培养过夜。第二天，往各孔中加入白花丹醌原始溶液，使得终浓度分别为0.0457、0.0228、0.0114、0.0057和0.0029 g·L－1，并调整使得每孔的DMSO溶剂为1%，每个浓度设7个复孔，同时设7个复孔的阴性对照，阴性对照中只加入DMSO至终浓度为1%。而后，对细胞孔进行显微照像。然后，继续培养48 h。

48 h后，首先，对细胞孔进行显微照像，往各孔中加入20 μL的浓度为5 g·L－1的MTT溶液，然后将96孔板放入细胞培养箱中37℃孵育4h。取出96孔板，弃去每孔中的上清，往每孔中加入150 μl的DMSO，吹打3次。将96孔板置于酶标仪于490 nm度数。根据读数，利用Excel的相关统计公式计算IC50。

2.2 检测白花丹醌对HepG2和SMMC-7721细胞的增殖及凋亡相关基因(Bax、Bcl-2、Cyclin D1)转录表达的影响 以2×105/孔的细胞量和3 ml/孔的体积接种HepG2、SMMC-7721细胞于6孔板。24 h后，往实验孔中加入4.57 g·L－1的白花丹醌原始溶液(由溶剂DMSO配制)至白花丹醌终浓度为0.0057 g·L－1，在对照孔中加入相应体积的DMSO使其中DMSO的浓度与实验孔一致。在5%CO2，37℃下继续培养48 h，分别使用RNA提取试剂提取RNA，再使用cDNA合成试剂盒合成cDNA，最后使用Qpcr试剂盒在荧光定量PCR仪上进行荧光定量PCR分析，操作按试剂盒和仪器的说明书进行。2.3 统计学处理 采用SPSS 17.0统计学软件，数据以±s表示，采用独立样本student's t检验分析比较各组间差异。

3 结果

3.1 白花丹醌抑制HepG2细胞的增殖 显微照像分析表明:浓度低至0.0057 g·L－1的白花丹醌溶液在与HepG2共培养后能明显改变细胞形态，改变后的细胞形态趋向细胞死亡形态(Fig 1)。说明白花丹醌抑制HepG2细胞的增殖。

检测不同浓度的白花丹醌对HepG2细胞增殖的抑制作用，结果如Tab 2。结果表明:各个浓度的白花丹醌都对HepG2细胞的生长有抑制，浓度低至0.0057 g·L－1时，仍有53.04%的抑制率。而后，通过利用 Excel软件分析，计算得出白花丹醌对HepG2的半数抑制率(IC50)为0.0067 g·L－1。

Fig 1 The microscopic images of HepG2cultured with 1%DMSOor 0.0057 g·L－1plumbagin for 48 h

Tab 2 The inhibitory effect of plumbagin at different concentrations on the proliferation of HepG2

3.2 白花丹醌上调HepG2细胞的Bax/Bcl-2，下调Cyclin D1基因的转录水平 根据“3.1”所述的结果，将白花丹醌的干预浓度选定在0.0057 g·L－1，在该浓度下干预HepG2细胞48 h。提取被干预的HepG2细胞的mRNA，接着合成cDNA，进行了QpcR检测。选择的被检测的基因为:(1)细胞凋亡相关基因 Bax和 Bcl-2;(2)细胞周期相关基因 Cyclin D1，选择以β-actin基因作为内参基因，检测结果如Tab 3。结果表明:白花丹醌明显上调了Bax/Bcl-2比值(P=0.0017)，同时明显下调了Cyclin D1基因的转录水量(P=0.0287)。

Tab 3 Effect of plumbagin on the Bax/Bcl-2 ratio and the transcriptional level of Cyclin D1 gene of HepG2

3.3 白花丹醌抑制SMMC-7721细胞的增殖 显微照像分析表明:浓度低至0.0057 g·L－1的白花丹醌溶液在与SMMC-7721共培养后能明显改变细胞形态，改变后的细胞形态趋向细胞死亡形态(Fig 2)。说明白花丹醌抑制SMMC-7721细胞的增殖。

Fig 2 The microscopy images of SMMC-7721 cultured with 1% DMSO or 0.0057 g·L－1plumbagin for 48 h

检测不同浓度的白花丹醌对SMMC-7721细胞增殖的抑制作用，结果如Tab 4。结果表明:各个浓度的白花丹醌都对SMMC-7721细胞的生长有抑制，浓度低至0.0057 g·L－1时，仍有88.48%的抑制率。而后，通过利用Excel软件分析，计算得出白花丹醌对SMMC-7721的半数抑制率(IC50)为0.0012 g·L－1。

Tab 4 The inhibitory effect of plumbagin at different concentrations on the proliferation of SMMC-7721

3.4 白花丹醌上调SMMC-7721细胞的Bax/Bcl-2，下调Cyclin D1基因的转录水平 根据“3.3”所述的结果，将白花丹醌的干预浓度选定在0.0057 g ·L－1，在该浓度下干预SMMC-7721细胞2 d。然后，提取被干预的SMMC-7721细胞的mRNA，接着合成cDNA，进行了QpcR检测。选择的被检测的基因为:(1)细胞凋亡相关基因Bax和Bcl-2;(2)细胞周期相关基因Cyclin D1，选择以β-actin基因作为内参基因，检测结果如Tab 5。结果表明:白花丹醌明显上调了Bax/Bcl-2比值(P=0.0104)，同时显著下调了Cyclin D1基因的转录水量(P=0.0165)。

4 讨论

白花丹醌是一种小分子萘醌化合物，其化学结构式为5-羟基-2-甲基-1，4-萘醌(5-hydroxy-2-methyL－1，4-napht--hoquinone)。其最早用于抗动脉粥样硬化、护肝、强心等。目前大量研究表明其对多种肿瘤细胞系有明显抑制作用。Bharathi等［6］通过动物实验研究表明，白花丹醌能够明显地抑制氧化偶氮甲烷诱发的小肠肿瘤;Sandur等［7］的研究表明:白花丹醌有可能是通过抑制NF-kappaB通路而达到抗肿瘤作用;Nair等［8］研究表明:其可通过诱导凋亡增加宫颈癌细胞对放疗的敏感性;刘超等［9－10］的研究表明:白花丹醌体外具有抑制人乳腺癌细胞mdamb-231生长的作用。

Tab 5 Effect of plumbagin on the Bax/Bcl-2 ratio and the transcriptional level of Cyclin D1 gene of SMMC-7721

肝癌是我国癌症死亡的第二大病因，晚期患者中位生存期短，目前的治疗方法不能明显延长生存期。本研究首先以通过显微照像发现白花丹醌对人肝癌细胞HepG2和SMMC-7721增殖有抑制，接着，MTT法检测表明白花丹醌能明显抑制人肝癌细胞HepG2和SMMC-7721的增殖，发现随着药物浓度增加，细胞存活率下降，而且对两种细胞的IC50都低于0.0100 g·L－1。实验还发现，白花丹醌对SMMC-7721的抑制作用大于对HepG2的作用，其原因将在下一步研究中探究。总而言之，上述结果表明白花丹醌能有效抑制两种肝癌细胞的增殖。

通过对白花丹醌抑制机制的探讨，发现其上调了HepG2和SMMC-7721的Bax/Bcl-2的比值，同时下调了Cyclin D1的转录水平。Bax/Bcl-2是凋亡相关指数［11］，其数值越高说明凋亡趋势越明显。Cyclin D1是细胞周期蛋白质，其含量随细胞周期的进展而变化，在G1/S交界区含量最高［12］，由于培养细胞的细胞周期不同步，所以总有部分细胞处于G1/S交界区，所以Cyclin D1总能被检测到，同时，其检测出来的含量能初步反映整个细胞群的增殖活跃的程度。上述结果阐明了白花丹醌对两种肝癌细胞增殖抑制的机制。

综上所述，白花丹醌能有效抑制人肝癌细胞的增殖，其机制与Bax/Bcl-2比值的上调和Cyclin D1转录水平的下调有关，说明白花丹醌具有抗肝癌的作用。

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