朱海燕，夏 花，高必达,2,3

（1.湖南农业大学生物安全科学技术学院，湖南 长沙 410128；2.植物疾病控制与利用湖南省高校重点实验室，湖南 长沙 410128；3.植物病虫害生物与防控湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128）

2011年在邵阳隆回地区龙牙百合基地发现生长期百合鳞茎腐烂病，受害鳞茎变褐腐烂，其病原经鉴定确认为尖孢镰刀菌百合专化型（Fusarium oxysporum f.sp.lilii）[1]。该病对百合生产造成重大影响，大田发病率达40%～60%[2]。为进一步了解该病菌病原特性，寻求最适防治方法，对该菌生物学特性进行了研究，并对防治药剂进行了筛选。

1 材料与方法

1.1 试验材料

病原菌为隆回县科技局提供的发病鳞茎上分离得到的尖孢镰刀菌百合专化型。供试药剂有75%百菌清可湿性粉剂（陕西先农生物科技有限公司），99%恶霉灵原药（山东烟台鑫润精细化工有限公司），5%己唑醇微乳剂（东莞市瑞德丰生物科技有限公司），10%苯醚甲环唑水分散粒剂（山东澳得利化工有限公司），50%代森锰锌可湿性粉剂（先正达作物保护有限公司），50%福美双可湿性粉剂（石家庄市绿丰化工有限公司），50%烯酰吗啉水分散粒剂（郑州先利达化工有限公司），嘧菌酯悬浮剂（山东禾木药业有限公司），3%中生菌素可湿性粉剂（深圳诺普信农业股份有限公司），12.5%烯唑醇可湿性粉剂（惠州市中讯化工有限公司），70%丙森锌可湿性粉剂（深圳诺普信农业股份有限公司），72%甲霜灵—锰锌可湿性粉剂（江苏高邮市丰田农业有限公司），200 g/kg腈菌·福美双（1∶9）可湿性粉剂（威海韩孚生化药业有限公司）

1.2 试验方法

1.2.1 温度对菌丝生长和产孢的影响 设置10、13、16、19、22、25、28、31、34、37 和 40℃ 共 11 个不同温度，将菌丝块接于PDA平板中央，分别置于预设温度的恒温箱中培养，5 d后测量菌落直径，7 d后测产孢量。

1.2.2 pH值对菌丝生长和产孢的影响 （1）pH值对菌丝生长的影响。用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配 制 pH 值 分 别 为 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0的 PDA 培养基，每个处理 4次重复；将直径为7 mm的菌饼接种于不同pH值的培养液中央，于25℃下恒温培养。5 d后，菌落长满全皿时，将菌落移出来，用滤纸吸干后称量鲜重，再烘干（65℃、24 h）称干重，根据不同pH条件下增加的重量来比较其菌丝生长速率。（2）pH值对菌落产孢的影响。配制 pH 值分别为 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0 的 PDA 培养基，将 7 mm菌丝块接种于平板中央，置于25℃恒温培养箱中，7 d之后测定产孢量。

1.2.3 不同光照条件对病原菌产孢及菌丝生长的影响 将7 mm的菌丝块移入150 mL液体查氏培养基中，设置连续光照、12 h光暗交替、完全黑暗3种不同光照处理，在27℃、200 r/min条件下培养5 d。每处理吸取1 mL菌悬液用无菌水稀释10倍，在显微镜下用血球计数板测定产孢量；每处理再量取140 mL培养液用定量滤纸过滤孢子，用相同大小的滤纸作对照，80℃恒温烘干至恒重，分别称量干重，并计算菌丝量。

1.2.4 分生孢子致死温度的测定 吸取1.2.3中光暗交替处理的菌悬液9 mL，过滤菌丝后吸取孢子悬浮液500 μL于薄壁的12个小离心管中；分别置于 42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62℃的水浴锅中水浴10 min；之后迅速置于冰上冰浴10 min；分别吸取100 μL不同温度处理后的孢子悬浮液于PDA平板上，均匀涂板，每个温度3次重复。25℃培养，5 d后观察菌落形成情况。

1.2.5 不同碳、氮源对菌丝生长及产孢的影响 以不加碳源的查氏培养基为基础培养基，分别加入含等量碳源的果糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇、半乳糖、葡萄糖、蔗糖、肌醇，以配成不同碳源培养基，无碳源培养基作为对照；同法以含等量氮源的硫酸铵、硝酸钠、硝酸钾、甘氨酸、脯氨酸、酪氨酸、精氨酸、肌氨酸、天冬氨酸配置不同氮源的培养基，以无氮源培养基为对照。以7 mm菌丝块接于不同碳源或氮源培养基上，28℃恒温箱中培养5 d后测量菌落直径，7 d后测定菌落产孢量。

1.2.6 杀菌剂的室内筛选 采用含毒介质法进行病原菌的室内药剂筛选试验。取直径7 mm的菌饼接种到事先配制的含药培养基上，每个处理重复3次，置于28℃恒温箱中培养，以无菌水为对照。每隔1天观察一次，5 d后用十字交叉法测量菌落直径。根据菌落平均直径求得各药剂抑菌率，采用DPS V7.0软件对药剂浓度、抑菌率进行统计分析，求得各杀菌剂毒力回归方程及EC50值。

2 结果与分析

2.1 温度对菌丝生长和产孢的影响

从图1中可以看出，该菌可在10～36℃温度下生长；最适生长温度为25～31℃，28℃时菌落生长最快；超过28℃，随着温度的升高，菌落直径不断减小。从产孢量来看，不同温度对产孢量影响较大，13～36℃下菌落均能产生孢子，28～35℃为最适产孢温度，34℃时产孢量达到最大。

图1 温度对尖孢镰刀菌百合专化型菌丝生长（5 d）及产孢（7 d）的影响

2.2 pH值对菌丝生长和产孢的影响

从图2中可以看出，菌落在pH值为4～12时均能生长，菌落菌丝净重在pH为5时达到最大。这表明：菌落在中性偏酸和碱性的环境都能生长，在弱酸性环境下菌丝净重增长最快，弱酸性环境中更有利于菌落生长。pH值对菌落产孢量的影响呈现双峰曲线，在中性偏酸（pH=6）或中性偏碱（pH=9）环境中更有利于该菌产孢。酸性环境下产孢量下降得更快，表明偏碱性环境中更有利于产孢。

图2 pH值对尖孢镰刀菌百合专化型生长（5 d）及产孢（7 d）的影响

2.3 不同光照条件对病原菌菌丝生长及产孢的影响

从表1中可以看出，光照对菌丝会产生一定的影响，以交替光照条件下菌丝生长和产孢情况最佳，全黑暗条件下菌丝生长和产孢情况最差。这说明交替光照条件下，有利于尖孢镰刀菌菌丝的生长和产孢；全黑暗条件对尖孢镰刀菌百合专化型菌丝的生长和产孢最不利。

表1 光照对尖孢镰刀菌百合专化型生长（5 d）及产孢（5 d）的影响

2.4 分生孢子致死温度的测定

分生孢子经不同温度处理后，在PDA培养基上产生的菌落个数有较明显差别。根据是否长出菌落，了解分生孢子的存活情况。结果表明，低于52℃处理，菌落可以生长，52℃或超过52℃处理不产生菌落。因此，判定该菌致死温度为52℃。

2.5 不同碳、氮源对菌丝生长及产孢的影响

2.5.1 碳源对尖孢镰刀菌百合专化型的影响 从表2中可以看出，尖孢镰刀菌百合专化型在果糖等8种碳源中均能生长。其中，在果糖、蔗糖中，生长最好；在半乳糖，α-乳糖中生长最差。在无碳培养基中，菌丝能生长，但菌丝较稀薄。尖孢镰刀菌百合专化型在果糖等7种碳源中均能产孢子。其中，葡萄糖、果糖产孢量最大，分别达到3.825×107个/皿、2.925×107个/皿；在半乳糖、麦芽糖中产孢量最小，分别为 6.45×106个/皿、7.80×106个/皿。在无碳培养基中不产孢。

表2 碳源对尖孢镰刀菌百合转化型菌丝生长和产孢的影响

2.5.2 氮源对尖孢镰刀菌百合专化型的影响 从表3中可以看出，尖孢镰刀菌百合转化型在L-精氨酸、硫酸铵、L-脯氨酸、硝酸钾、甘氨酸、L-酪氨酸、天冬氨酸、无氮培养基中均能生长。其中，在天冬氨酸、L-脯氨酸中，菌落直径最大；在硫酸铵、甘氨酸中，菌落直径最小。在无氮培养基中，菌丝能生长，但菌丝较稀薄。尖孢镰刀菌百合转化型在L-精氨酸、硫酸铵、L-脯氨酸、硝酸钾、甘氨酸、L-酪氨酸、天冬氨酸中均能产孢。其中，硝酸钾的产孢量最多，达到7.507 5×108个/皿；其次是 L-酪氨酸，达到 8.527 5×107个/皿；在硫酸铵中产孢最少，只有6.75×105个/皿。在无氮培养基中不产孢。

表3 氮源对尖孢镰刀菌百合转化型菌丝生长及产孢的影响

2.6 杀菌剂的室内筛选

为了解各杀菌剂对尖孢镰刀菌百合专化型菌株的作用，试验测定了75%百菌清WP等13种常用杀菌剂对尖孢镰刀菌百合专化型菌株的EC50值，结果如表4。13种杀菌剂的EC50值大小顺序为：72%甲霜灵-锰锌>50%烯酰吗啉>70%丙森锌>嘧菌酯>50%代森锰锌>50%福美双>75%百菌清>99%恶霉灵>3%中生菌素>5%己唑醇>10%苯醚甲环唑>腈菌·福美双>12.5%烯唑醇。其中，12.5%烯唑醇WP、腈菌·福美双WP、10%苯醚甲环唑WG、5%己唑醇ME、3%中生菌素WP抑制病菌菌丝生长效果最好，EC50分 别 为 1.080 4、2.228 4、2.616 2、5.121 2、16.192 0 mg/L。75%百菌清WP、99%恶霉灵DP、50%福美双WP抑菌效果次之，EC50分别为70.780 9、62.958 2、71.270 9 mg/L。50%代森锰锌 WP、70%丙森锌、50%烯酰吗啉WG、72%甲霜灵-锰锌WP效果最差，EC50分别为 216.149 0、611.299 7、830.275 5、4 614.198 4 mg/L，远高于其他药剂的EC50。

表4 不同杀菌剂对尖孢镰刀菌百合专化型菌株的毒力测定

3 结论与讨论

3.1 百合鳞茎腐烂病的生物学特性

对尖孢镰刀菌百合专化型生物学特性的研究结果表明，菌丝生长最适温度为28℃，产孢最适温度为34℃；孢子致死温度为52℃；pH在4～12的范围内该菌均能生长和产孢，pH值为5时菌丝生长最快，pH值为6时产孢量最大；交替光照对菌丝生长、产孢最好；在供试碳源中，菌丝生长及产孢均以果糖最好；在供试氮源中，天冬氨酸最利于菌丝生长，硝酸钾最利于产孢。这些结论与朱茂山[3]、李晓琴[4]等对尖孢镰刀菌生物学特性研究报道基本一致，但在最适pH值、光照影响等方面存在一定的差异。

3.2 室内药剂的筛选

试验中苯醚甲环唑、恶霉灵、腈菌·福美双、代森锰锌、丙森锌、烯酰吗啉、甲霜灵-锰锌的抑菌效果与梁巧兰等对尖孢镰刀菌药剂防治研究的结果基本一致[5-8]。其中抑菌效果最好的烯唑醇、腈菌·福美双、苯醚甲环唑、己唑醇均属于三唑类杀菌剂。三唑类杀菌剂是一类重要的内吸性杀菌剂，其用于尖孢镰刀菌的防治的报道还不多见，仅在安智慧等[6]对百合镰刀菌枯萎病防治药剂的研究中首次提到三唑类杀菌剂对百合枯萎病防治效果好。该试验通过进一步研究，验证了三唑类药剂对尖孢镰刀菌的防治效果。

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