严之红 郭威早 佟 倩

(航天中心医院高干二科，北京 100049)

缺血再灌注(IR)损伤是脑血管疾病组织损害中核心病理因素之一〔1〕。研究显示，细胞外调节激酶(ERK)信号通路在IR损伤的修复机制中具有重要作用〔2〕，而脑源性神经营养因子(BDNF)对神经损伤的保护作用亦获得了明确的实验依据，并且这种保护作用的分子机制与ERK信号通路关系密切〔3〕。然而，BDNF和ERK信号通路在IR损伤中的关系目前尚不明确。本文旨在研究BDNF在IR损伤中的神经保护作用及其与ERK信号传导的关系。

1 材料与方法

1.1 IR损伤动物模型 体重250 g左右的健康雄性SD大鼠被随机分为A、B、C三组，每组6只，所有的大鼠均经历脑局灶性缺血再灌注过程。MCAO缺血再灌注参考文献〔4〕报道并作适度改良，具体操作方法:以10%(w/v)水合氯醛按400 mg/kg的剂量经腹腔注射对大鼠实施麻醉。在大鼠颈部中线由下颌至胸骨实施切口，将颈部肌肉向旁剥离以便暴露颈总动脉。将Dermalon 3-0号单纤维手术缝线末端用炽热前状态的金属片烙约1 s，使末端钝化，然后在距末端20 mm处标记。双侧颈总动脉以微型血管夹断流，在右侧颈内动脉和颈总动脉的分叉附近切口，将端头钝化处理的手术线插入，沿颈内动脉上行约20 mm，遇阻力后即停止。脑缺血状态持续45 min，然后将微型血管夹和手术缝线撤除，使再灌注保持12 h。

1.2 BDNF的应用及ERK信号通路的阻断 冷冻干燥的BDNF蛋白结晶和选择性Raf-1抑制剂均由美国国立精神卫生研究所生物标记实验室赠送。将BDNF溶于pH7.4磷酸盐缓冲液配成1μg/μl的溶液备用。将Bay 43-9006溶于二甲基亚砜(DMSO)配成5 ng/μl的溶液备用。A组大鼠在进入IR之前6 h，在每只大鼠的右脑室注射2μl pH7.4磷酸盐缓冲液;B、C两组大鼠在进入IR之前6 h，在每只大鼠的右脑室注射2.0μg BDNF。A、B两组大鼠在进入IR之前12 h，在每只大鼠的右脑室注射2μl DMSO，C组大鼠在进入IR之前12 h，在每只大鼠的右脑室注射10 ng Bay 43-9006。

1.3 脑损伤的组织化学评估 对每个大鼠按常规步骤开颅及分离脑，切除嗅球及少量顶端前额叶组织，然后切取额叶，固定48 h，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，每隔1 mm行额状切片并进行编号。切片经常规甲酚紫染色和显微拍照后，采用Image-Pro Plus(Media Cybernetics，v6)图像分析确定和比较脑损伤的面积〔5〕进行。脑损伤的程度以组织损失的百分比表示。

1.4 蛋白免疫印迹杂交 根据本课题组既往报道〔6〕的方法进行，针对组织特点进行了适应性改变。将约100 mg脑组织浸入1 ml冰冷的裂解缓冲液，匀浆后通过Virtis超声细胞粉碎仪进行超声剪切(设置2.0，处理1 s×10次)，然后离心5 min去除不溶性沉渣。蛋白浓度测定采用Pierce公司BCA蛋白试剂盒进行。等量的蛋白加入到8% ～16%SDS-PAGE进行电泳分离，然后电转移至硝酸纤维素膜。硝酸纤维素膜上的非特异结合通过以下杂交液屏蔽。杂交液包括Tris缓冲盐水，0.1%吐温-20，5%脱脂牛奶。ERK抗体(抗 ERK 1/2，即抗 p44/p42)，磷酸化ERK抗体(抗202位苏氨酸磷酸化的ERK 1/2)购自Santa Cruz生物技术公司，实验中采用1∶500的比例稀释。次级抗体为辣根过氧化物酶耦联的抗山羊(运用于ERK1/2)或抗兔(运用于pERK1/2)抗体。免疫复合物用Amersham ECL加强型试剂盒探测。免疫印迹的定量分析采用Syngene凝胶建档及分析系统进行。

1.5 统计学方法 采用SPSS11.5软件进行ANOVA，Tukey Post-Hoc及t检验。

2 结果

2.1 BDNF对于IR损伤具有明显的保护作用 在单纯IR损伤组(A组)，脑组织损伤面为(16.48±5.72)%;在使用BDNF预处理的情况下(B组)，脑组织损伤面为(6.32±3.08)%，较A组显著减少 (P=0.039);与未使用BDNF的A组比较，损伤面积减少到原来的38.3%。然而，在使用BDNF的同时使用选择性Raf-1抑制剂(C组)，则BDNF的神经保护作用被明显稀释，脑组织损伤面积又回升到(11.40±3.28)%，与A组已经不构成显著差别。

2.2 Bay 43-9006抑制ERK通路的活性水平 B组和C组使用了相同剂量的BDNF预治疗，但C组同时使用了选择性Raf-1抑制剂Bay 43-9006。因为Raf-1是ERK信号通路中的重要信号分子，因此，以磷酸化水平所代表的ERK信号传导活性水平显著降低。ERK1(p44)的磷酸化水平由B组的(51.73±13.06)%下降至C组的(25.34±12.12)%，具有高显著性差异(P=0.008 4)。ERK2(p42)的磷酸化水平由B组的(81.16±17.03)%下降至C组的(50.42±14.56)%，差异亦具有显著性(P=0.029)。

3 讨论

因既往研究显示BDNF的神经保护作用经由ERK信号传导通路介导〔7〕，因此在本文观察到BDNF对IR损伤的保护作用之后，在机制方面聚焦到ERK信号传导。与笔者的理论预计一致，当ERK信号通路上的Raf-1这一关键信号分子被Bay 43-9006选择性抑制后，BDNF的神经保护作用也被显著抵消。综合以上观察结果，笔者推论，在脑IR过程中，ERK信号传导介导了BDNF的神经保护。但这一推论仍然只能作为一个具有局限性的初步结论，是一个深入研究的起点。Bay 43-9006的生物学活性并非仅限于Raf-1信号分子的抑制〔8〕，因此目前的研究结果需要谨慎解释。

IR损伤的病理机制广泛而复杂，在分子病理水平上尤其如此，这其中涉及多个信号传导通路、细胞因子和神经递质等〔9〕。在脑IR损伤中，ERK的激活具有促进DNA修复、抑制细胞凋亡、保护神经元的作用〔10〕，具有潜在的临床运用价值。其实，对ERK通路的调节不仅有BDNF，还有其他很多的分子、受体、细胞因子、激素等，甚至一些心血管药物也同样具有ERK的调节作用〔11〕。积极利用这些调节途径，促进IR损伤的修复和相应疾病的预后，会对治疗诸如缺血性脑中风等心脑血管疾病具有积极的促进作用。

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