王 琰 徐瑞荣 (山东中医药大学附属医院血液病科，济南250011)

再生障碍性贫血(Aplastic anemia，AA，简称再障)是由多种原因引起的造血干细胞数量下降和功能异常，导致全血细胞减少的一种综合病症，是骨髓衰竭综合征的一种。AA可以分为获得性和遗传性的，获得性AA又分为原发性AA和继发性AA两类。近年来，端粒和端粒酶成为生命科学研究的热点之一，在获得性AA中发现，部分患者与同年龄组的正常人相比端粒缩短。对骨髓衰竭综合征包括获得性AA患者来说，具有潜在的白血病转化倾向和高的实体瘤发生率，提示端粒和端粒酶的异常对再障的发生、发展、治疗及转化都有一定的影响，现就再障与端粒、端粒酶及保护端粒的蛋白复合体Shelterin的相关研究作一综述。

1 端粒与再障

1.1端粒 端粒是真核细胞内线性染色体末端的一种特殊“帽状”结构，由端粒DNA和端粒蛋白组成。其生物学功能是防止染色体末端的降解、丢失及端-端不规则融合，对维持染色体的完整性和稳定性有重要作用。人类在出生的时候端粒约有10～15 kb，随着细胞的分裂次数增加，端粒的长度不断地缩短，在人有核血细胞，平均端粒长度随年龄增大而显著减小，特别是免疫系统的细胞。当端粒缩短达到一个临界长度(2～4 kb)时，就会认为是双链断裂DNA损害，丧失保护染色体末端的功能，导致不可逆地退出细胞周期，从而走向衰亡［1］。

1.2端粒长度与再障的发病 近年来的研究发现，大约1/3的获得性再障患者有白细胞端粒缩短，用流式-荧光原位杂交方法、Southern blot方法、定量聚合酶链反应(PCR)法等检测都得出了相似的结果［2-4］，再障患者粒细胞端粒长度较同年龄段正常组明显缩短，外周血单个核细胞的端粒长度平均比年龄匹配的正常对照组短1.41 kb(P＜0.001)。端粒的缩短与外周血中性粒细胞减少的程度和治疗后血象的提升有正相关，与疾病发现的早晚并无相关性，提示再障在发病时就失去了部分端粒长度，再障端粒的缩短可能反映了造血干细胞造血功能的缺陷。

端粒侵蚀也可能为我们提供有关疾病阶段的信息。在持续性血细胞减少的获得性再障患者，端粒损失和病程之间存在显著相关(P＜0.0001)［5］，除了正常的年龄有关的损失，相当于端粒逐渐侵蚀216 bp/年。研究发现，中间型再障患者有显著的端粒缩短(P=0.01)，对这组的病程分析显示，这组患者有很长的血细胞减少史［2］。重型再障和外周血单核细胞的个人年度端粒缩短的速率(IATSR)显著相关(P＜0.001)，自发性细胞凋亡在重型再障患者或高的IATSR患者中最高(大于200 bp/年)(P＜0.01，n=18)［6］。

1.3端粒长度与再障的演变及治疗 对获得性再障患者来说，白细胞端粒长度是恶性克隆发展的重要预测指标，且与再障的复发及死亡率有关，并与血液复发概率成反比。端粒越短，发生克隆演变的可能性就越高［4］。成人端粒较短的再障患者转化为骨髓增生异常和白血病的可能性最高［7］。有研究发现，在5例端粒长度小于5 kb的再障患者中，2例进展期的获得性再障患者有细胞遗传学异常，反映了骨髓已经出现深度发育不良，提示端粒侵蚀可能与再障演变为骨髓增生异常综合征的发病机制相关［5］。

同时，在研究中也发现，基于再障发病的免疫基础，高达75%的再障患者对免疫抑制治疗(IST)有反应［8］。那些对免疫抑制治疗反应良好和服用免疫抑制剂恢复的患者，端粒平均长度与同年龄段的正常对照组并无明显差异，而一些对免疫抑制剂反应差或未进行治疗的三系严重减少的患者端粒长度明显缩短，并与正常组差异明显。而对于接受免疫抑制治疗的重型再障患者来说，端粒长度与治疗效果无关，但与复发的风险，克隆演化，整体存活率有关［4］。这提示我们在临床治疗再障过程中，通过检测端粒的长度，可以更好地有针对性地治疗再障，并对再障的预后有初步的评断。

2 端粒酶与再障

2.1端粒酶 端粒酶是由RNA和蛋白质组成的一种核糖核蛋白。是一个特殊的反转录酶，活化后以自身RNA为模板，端粒3＇末端富G单链为引物合成端粒中重复DNA序列加到端粒末端而维持端粒长度，以防止端粒随细胞分裂而不断损耗，从而保护染色体。哺乳动物的端粒酶复合物主要有反转录酶(Telomerase reverse transcriptase，TERT)和 RNA 模板(Telomerase RNA component，TERC)组成。此外，另外四个蛋白 GAR1、NHP2、NOP10和 dyskerin组成核仁核糖蛋白复合物结合端粒酶，这些蛋白的缺失会导致端粒酶失活。

除在生殖细胞、成体干细胞、胚胎干细胞和活化的免疫细胞外，端粒酶在正常体细胞中无活性或检测不出其活性。当端粒长度足够长时，端粒酶活性对细胞分裂不是必需的，只有当端粒的长度缩短到特定范围时，端粒酶活性的有无才成为关键因素。端粒酶活性主要由TERT表达水平的高低决定。TERT的突变会导致端粒酶活性的改变。

2.2端粒酶基因突变与再障的发病机制 在获得性再障患者中发现复杂的端粒酶基因的遗传突变对再障的临床管理有重要意义。端粒酶基因的突变可导致再障患者端粒酶活性降低，端粒缩短加速，减少造血祖细胞增殖能力。在1/3有端粒缩短的获得性再障患者中有一部分伴有端粒酶的突变(TERC基因或 TERT基因)，约占所有获得性再障患者的4% ～10%，但没有发现 DKC1、NOP10和 NHP2的突变，虽然在这些基因分析中发现非同义单核苷酸多态性，但与对照组有类似的总体等位基因频率［9-11］。

研究发现，遗传性TERC突变导致的端粒酶活性和端粒维持损失，可能会限制骨髓干细胞再生［12］。在再障患者中，有一些TERC突变与端粒维持通路的遗传病变有关，有一些突变能破坏TERC的二级结构或折叠［13］。经过一项正常和突变TERC分子的端粒酶重组实验表明，TERC的突变是由于单倍剂量不足引起的。在无负性干扰的情况下，TERC的变异使端粒酶活性降低或取消，导致端粒合成功能的丧失［14］。在中国北方再障患者的血液样本中也检测出了 TERC突变，发生率与西方相似［15］。

有报道，TERT基因的突变是通过单倍剂量不足机制破坏了端粒酶活性，从而造成了白细胞端粒缩短和造血干细胞室的增殖能力有限［9，10］。有TERT突变的患者外周血白细胞端粒明显缩短，且发现有突变患者的亲属也具有造血障碍，其CD34细胞数的减少、造血集落形成减少、造血生长因子水平增加以及短端粒［16］，揭示了基因突变的家族倾向。体外培养突变的患者及亲属的外周血白细胞发现，培养细胞的端粒酶活性较正常对照组减少了约50%，说明TERT突变相关再障降低端粒酶活性的机制是单倍剂量不足：即其余的正常等位基因不足以生产足够数量的酶。另有不同的研究发现，在慢性再障患者中骨髓单个核细胞的端粒酶活性是增高的。Shen等［17］在22例儿童再障患者中测定了骨髓单个核细胞的端粒酶活性，高于正常对照组的两倍，分析端粒酶活性增加与再障患者潜在的造血负反馈有关。两种不同的研究结果说明关于端粒酶的活性在获得性再障的研究中还存在争议，有待于大量的实验数据的进一步验证。

TERT和TERC的突变可以被视为人类基因造血衰竭的危险因素。端粒长度维持缺陷导致造血干细胞室减少，可能会特别容易受到环境伤害。

2.3端粒酶基因突变与再障的治疗选择 对获得性再障患者来说，抗胸腺细胞球蛋白加环孢素的免疫抑制剂和造血干细胞移植是主要治疗方法。Yamaguchi等［9］在再障患者的临床治疗中发现，200例获得性再障患者中7例有TERT突变的患者，没有一例对免疫抑制治疗有反应，表明一个或多个特定基因的突变可能会影响治疗的选择——选择具体的药物治疗方案或决定接受干细胞移植。对于要接受干细胞移植的患者，合适的供者选择很重要，再障患者基因突变的检测为端粒酶缺陷的病人移植选择合适的造血干细胞家属捐赠者提供了依据［18］。基于这个原因，测量血液中白细胞端粒长度和进行端粒酶基因突变的检测在获得性再生障碍性贫血的管理中很重要。

此外，端粒酶活性的调节可能在有端粒缺陷的综合征的治疗中发挥作用，如端粒酶突变的获得性再障。端粒酶活性可被性激素调控。临床观察发现，雄激素治疗可诱导改善外周血计数，60%的患者能够达到不依赖输血［19］。机制可能是雄激素能刺激造血细胞中端粒酶基因表达，包括CD34+细胞和淋巴细胞［20］。此类研究对于当前雄激素化合物的选择和临床使用的未来发展有潜在影响［21］。但需要注意的是，雄激素治疗可能引起严重不良反应，如肝癌、肝紫斑病等，必须监测肝功能。

3 Shelterin与再障

3.1Shelterin 哺乳动物细胞中端粒的结合蛋白是由六个蛋白组成的端粒特异性蛋白复合体，这个复合体被称之为Shelterin，包括端粒重复序列结合蛋白 1(Telomere repeat binding factor1，TRF1)、端粒重复序列结合蛋白2(Telomere repeat binding factor1，TRF2)、Rap 1(Repressor activator protein 1)、TIN 2(TRF1-interacting nuclear protein 2)、TPP1(以往被分别称为TINT1或PTOP或PIP1)和端粒保护蛋白1(protection of telomeres 1，POT1)六个蛋白。这些Shelterin组分特异性地结合在端粒上，并且在细胞周期的各个阶段都有表达。TRF1和TRF2与端粒双链DNA直接结合，Rap1通过和TRF2相互作用而结合在端粒上;TIN2则在很大程度上发挥了一种桥连作用，同时和TRF1、TRF2以及TPP1相互作用;POT1直接与端粒的单链DNA结合;TPP1同时与TIN2以及POT1相互作用连接起Shelterin在单链DNA和双链DNA结合的蛋白复合物，从而形成一个庞大的六元复合体结合端粒末端。

Shelterin的两个主要功能是端粒酶的募集，调节和保护染色体末端。染色体末端缺乏端粒保护将激活DNA损伤反应，而Shelterin的存在使得细胞得以区分端粒末端和普通的DNA双链断裂(DNA double strand break，DSB)，从而抑制DNA损伤修复蛋白，避免染色体末端异常融合，同时调控端粒的端粒酶延伸途径。因此，Shelterin的稳定对于端粒的维持有着至关重要的作用。随着端粒序列的延伸，结合在端粒末端的Shelterin会越来越多，因此也存在counting机制来维持端粒的长度。研究显示，Shelterin的组分出了具有特定的功能外，对于端粒的长度都有负调控作用。

3.2Shelterin与再障的发病及治疗 1/3的再障患者有短端粒，但突变只有不到10%，对这一现象最有趣的解释是因为有其他基因的参与，包括大型复杂修复的其他成员、Shelterin、仍然模糊的替代修复系统的组成部分和一些DNA解旋酶［22］。

研究发现，Shelterin组件(TERF1和TERF2)特定的基因单体型编码，可能有助于疾病发病，TRF1和TRF2是直接绑定到端粒DNA链，在调节端粒长度的同时保护端粒不被损坏，突变减少了它们的表达或者减少了它们绑定到DNA的数量导致了端粒侵蚀。也可能因为突变导致造血干细胞室的数量减少，使其可能在数量上不足以维持免疫介导的损伤。Savage等［23］通过对获得性再障患者和健康对照的TERF1和TERF2基因单核苷酸多态性(SNP)对比分析认为，TERF1的遗传变异可能与AA风险增加有关，但仍需要更多的研究证实;TERF2的变异与再生障碍性贫血没有显著相关。

有报道在1～5%的获得性再障患者中检测出了TINF2的杂合子突变，但TINF2的突变在非先天性角化不良患者中不起主要作用［24］。Yamaguchi等［25］在排除了携带端粒酶基因突变基因TERC or TERT的2例(1.4%)日本获得性重型再障患者中发现有TINF2杂合突变，且与正常相配年龄的健康人比较，有更短的端粒长度。对免疫抑制治疗无反应。用美替诺龙治疗，没有显示出任何良好的临床反应，这与用雄激素治疗TERT突变的骨髓衰竭综合征有良好的血液学反应不同。

4 展望

近几年来，再障与端粒、端粒酶及其相关蛋白之间的关系研究日益受到血液学研究者的重视。目前的研究基本都集中在测定外周血及骨髓端粒长度、端粒酶活性及端粒相关蛋白基因突变等方面，研究者们试图从中找出规律，为再障患者的发病、疾病进展及转化提供有益的指导，尤其是对临床应用价值更大的端粒酶突变的研究，如果发现出现突变，可作为免疫抑制剂治疗无效的一个指标，为临床针对性更强用药提供依据。另外，对出现端粒酶突变的患者来说，如果选择造血干细胞移植治疗，其同胞供者的端粒酶突变检测也很重要，不排除患者的同胞健康供者之一亦会有端粒酶突变。这种情况下，则强烈提示我们此再障患者的发病有家族、遗传、先天性因素参与。此时，应高度怀疑先天性骨髓造血衰竭，并做相应的检查及鉴别诊断，此种情况下，同胞供者的骨髓移植并非最佳首选，应考虑无关供者的骨髓移植。端粒及端粒酶的深入研究将为再障患者寻找最适治疗方案提供帮助，以期达到提高再障患者的生存率及治愈率的目的。

端粒、端粒酶、Shelterin之间相互作用，是密切相关的。目前的研究结果揭示了一部分获得性再障患者存在外周血白细胞端粒缩短、端粒酶基因和部分端粒保护蛋白突变、外周血端粒酶活性降低而骨髓端粒酶活性升高的现象，这部分患者可能有遗传背景，在治疗的选择上也更为慎重。但对再障患者端粒相关的基因蛋白的表达水平及相互作用关系，及可能参与的疾病发生发展信号通路等少有具体研究和报道。鉴于目前Shelterin研究的内容尚不全面，已知的六种蛋白它们之间的相互作用及其相互关联与再障发生发展的关系目前尚不清楚，这将是今后需要研究的重点。目前，关于再障患者遗传方面的研究包括染色体核型改变、基因突变等都有一定进展，但是关于染色体末端的构成部分——端粒、端粒酶以及端粒保护蛋白的研究远不完善，这为今后的研究提供了很大的空间。进一步研究它们及其之间的关系有望为获得性再障患者的临床管理提供更准确的依据。

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