张秀娟, 李学家, 夏机良, 颜孙兴, 季 芳, 张艳春, 刘晓明,, 彭白露,,*

(1. 广东省昆虫研究所， 广东 广州 510260； 2. 广东蓝岛生物技术有限公司， 广东 广州 510555)

中老年食蟹猴群中糖尿病相关基因的表达状态

张秀娟1, 李学家1, 夏机良1, 颜孙兴2, 季 芳1, 张艳春1, 刘晓明1,2, 彭白露1,2,*

(1. 广东省昆虫研究所， 广东 广州 510260； 2. 广东蓝岛生物技术有限公司， 广东 广州 510555)

该研究选择10岁以上健康中老年食蟹猴138只, 按空腹血糖值(FPG)将其分为低血糖组、血糖正常组和高血糖组。采用全自动血液生化仪分别检测各组血清中总胆固醇(TCHO)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的水平变化; 采用荧光定量PCR分析食蟹猴外周血白细胞中37个糖尿病相关基因的mRNA表达情况。结果表明, 血清血脂水平HDL-C、LDL-C、TCHO和TG都与FPG分组无显著相关性(P＞0.05), 而外周血白细胞中ACE、ACLY、PRKCB1、SLC2A4、SNAP23、VAPA、IGF2BP2、IFNG8个基因的mRNA表达水平随FPG的升高而显著上调(P＜0.05)。

食蟹猴; 血脂; 外周血白细胞; 糖尿病; 基因表达

糖尿病是一种慢性代谢性疾病, 其中90%以上的患者为2型糖尿病。据世界卫生组织(WHO, 2009)估计, 全世界有超过2.2亿的糖尿病患者, 2030年可能会增加到3.6亿。糖尿病已成为仅次于癌症、心脑血管病的人类第三大疾病。

2型糖尿病患者容易引发各种并发症, 如糖尿病肾病、视网膜病变等, 而且糖尿病是导致心血管疾病最重的因素之一。目前, 我国主要将空腹血糖、糖耐量2 h血糖，以及随机血糖水平作为诊断糖尿病的依据。新近, 美国糖尿病协会(ADA)提出新增糖化血红蛋白(HbAlc)≥6.5%作为诊断糖尿病新标准, 将 HbAlc处于 5.7%～6.4%之间者以及空腹血糖受损和糖耐量受损的个体统称为糖尿病风险增高人群。然而, 上述指标很难检测糖尿病的早前期,鉴于糖尿病的高危害性和难治愈性, 因此, 需要寻找新的糖尿病早前期诊断方法和技术, 以便对糖尿病进行更早发现和更早防治。

随着人们对糖尿病发病机理的不断认识, 从分子生物学水平对糖尿病的早期诊断和风险预警已有可能。若能掌握糖尿病相关基因在糖尿病发病进程中的表达模式, 再结合血糖等常规检测指标, 有望更好地对糖尿病进行风险预警和早期诊断。近年来, 有研究糖尿病相关基因的多态性来预测糖尿病风险(Jeon et al, 2010); 外周血白细胞中基因表达情况可间接反映个体糖尿病状况(Kaizer et al, 2007;Takamura et al, 2007; Jin et al, 2011)。

非人灵长类动物食蟹猴的生物学特性、生理、遗传、解剖特征等与人非常相似。Tigno et al(2004)发现自发性2型糖尿病食蟹猴, 在发病过程中也经历与人类2型糖尿病相似的胰岛素抵抗、糖代谢异常和高胰岛素血症等阶段。近年来, 食蟹猴越来越多地被用于糖尿病相关研究中。为了调查一些糖尿病相关基因与糖尿病发病病程关系, 本研究以 138只中老年食蟹猴为主要研究对象, 以空腹血糖(FPG)为分组依据, 检测其常规血液生化指标。同时, 采用荧光定量 PCR分析其外周血白细胞中糖尿病相关基因的表达情况与FPG的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选择 10岁以上中老年健康、普通饲养的食蟹猴共计138只(其中雄性65只, 雌性73只), 广东蓝岛生物技术有限公司提供食蟹猴。

1.2 血清生化指标的测定与实验动物分组

血清样本的采集：食蟹猴禁食14～16 h后, 隐静脉采血3 mL, 置于促凝管中, 室温放置30 min,4 000 r/min离心20 min分离血清, 立即检测FPG、TCHO、TG、HDL-C和LDL-C五项指标(日立7020全自动生化分析仪)。

实验动物分组：以中老年食蟹猴FPG为因变量,对FPG进行正态分布检验, 剔除极值, FPG数值基本接近于正态分布。参考本实验室对食蟹猴血糖值的调查分析(Hao et al, 2011), 本研究根据FPG值将研究对象分为三组, 即低血糖组(第Ⅰ组)(FPG＜3.20 mmol/L)、血糖正常组(第Ⅱ组)(3.20 mmol/L≤FPG＜5.50 mmol/L)和高血糖组(第Ⅲ组)(FPG≥5.50 mmol/L)。

1.3 提取外周血白细胞总RNA及其cDNA的制备

股静脉采血 3 mL置于含肝素抗凝管中, 将其与15 mL红细胞裂解液(Ma et al, 2007)(1.6 mmol/LEDTA, 10 mmol/L KHCO3, 153 mmol/L NH4C1,pH 7.4)混匀, 冰上放置 30 min, 201 g离心 5～10 min收集外周血白细胞, Trizol法(Invitrogen)提取外周血白细胞总RNA, 通过凝胶电泳检测RNA的质量, 并计算其浓度。取大约 0.5 µg RNA, 用EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix将RNA 逆转录成 cDNA, 所得 cDNA 于−20 ℃保存备用。

1.4 荧光定量PCR反应

37个糖尿病相关基因可在食蟹猴外周血白细胞中有效表达(郝香芬, 待发表), 因此, 本研究采用荧光定量PCR检测这37个糖尿病相关基因在中老年食蟹猴外周血白细胞中的 mRNA表达状况。这37个基因按功能分为如下6类：

代谢酶类：ACE、ACLY、G6PD、GSK3B、HMOX1、IDE、PRKCB1、PYGL; 受体、通道和运输蛋白类：AQP2、CCR2、CEACAM1、CTLA4、GCGR、ICAM1、NSF、RAB4A、SELL、SLC2A4、SNAP23、STX4、STXBP2、TNFRSF1A、VAMP3、VAPA; 分泌因子类：AGT、IFNG、INS、TNF; 信号转导类：IGFBP5、PIK3C2B、PIK3R1、IκBα; 转录因子类：NEUROD1、PPARGC1、IGF2BP2; 肥胖相关：CDKN2B、FTO。

以GAPDH作内参(Sluimer et al, 2007), 所有糖尿病相关基因和内参的 PCR产物长度均在 200～300 bp之间。采用SYBR GreenⅠ染料(TaKaRa)在Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System上进行荧光定量PCR, 荧光定量PCR为20µL 反应体系：10 µL SYBR®Premix Ex TaqTM(2×),0.4 µL PCR Forward Primer(10 µmol/L), 0.4 µL PCR Reverse Primer(10 µmol/L), 2 µLcDNA, 7.2 µL ddH2O。荧光定量PCR反应步骤：(1)95 ℃, 30 s;(2)95 ℃, 5 s; 60 ℃, 34 s, 共 40 个循环; (3)溶解曲线分析采用系统默认设置(即95 ℃, 15 s; 60 ℃ , 1 min;95 ℃ , 15 s; 60 ℃, 15 s; 速度为 1.6 ℃/s)。所有基因PCR产物均纯化回收, 并测序验证, 并将测序结果与华大基因食蟹猴数据库中相应基因比对验证。所有荧光定量PCR反应均重复三次。

1.5 数据处理和分析

采用 Applied Biosystems StepOne™ Software v2.1对荧光定量PCR结果进行初步分析, 以低血糖组为参照样本, 2—△△Ct法分析各基因的相对表达量,相关数据以±S表示。用软件SPSS17.0单因素方差分析(one-way ANOVA),P＜0.05认为有显著性差异。

2 结 果

2.1 中老年食蟹猴血清血糖与血脂的关系

本研究分析了4个脂代谢相关血液生化指标与FPG水平的关系(表1), 统计结果表明, FPG在3组之间差异极显著(P＜0.01), 而 HDL-C、LDL-C、TCHO和TG都与FPG无明显相关性(P＞0.05)。

2.2 糖尿病相关基因在中老年食蟹猴中的表达分析

去除无扩增荧光信号、溶解曲线差、Ct＜ 8或Ct＞ 35及△Ct＞13的荧光定量PCR反应, 采用2－△△CT法计算各基因相对于低血糖组食蟹猴中相应基因的表达量, 结果如表2、3所示。在高能量膳食诱导的小批量食蟹猴的全病程糖尿病模型中可检测到有 37个糖尿病相关基因有效表达(郝香芬, 待发表), 其中每个基因均有其独特的表达模式(在不同的发病阶段中有不同的表达状态)。然而, 可能由于个体遗传差异造成在大样本群体中的集合, 使某一基因的表达状态在群体中出现较宽的分布。为便于对糖尿病风险程度的评估, 我们将这一分布状态划分为高表达水平、中等表达水平和低表达水平。

表1 不同FPG组与4个血生化指标的统计分析(x±S) (mmol/L)Tab. 1 Statistical analysis of different FPG groups and four blood lipid biochemical indicators(x±S)

表2 与FPG显著相关的8个糖尿病相关基因的相对表达量分析(x±S)Tab. 2 Relative expression analysis of eight diabetes related genes significantly associated with FPG(x±S)

表3 29个糖尿病相关基因在中老年食蟹猴群中的相对表达量分析(x±S)Tab. 3 Relative expression analysis of 29 diabetes-associated genes in middle or aged cynomolgus monkeys (x±S)

续表

续表

从表2、3可以得出, 37个糖尿病相关基因的总体平均表达水平普遍存在标准偏差比较大的现象,经 SPSS17.0软件统计分析获得ACE、ACLY、PRKCB1、SLC2A4、SNAP23、VAPA、IGF2BP2、IFNG等8个基因的总体表达水平随空腹血糖的升高而显著上调(P＞0.05), 详见表 2。而其他基因的表达模式与FPG分组无显著相关性(详见表3)。各个基因按照基因表达量的正态分布将食蟹猴群分为三类表达水平方式, 数据统计结果显示此三类表达水平随FPG的表达趋势与总体平均表达趋势呈现一致。

3 讨 论

目前临床上主要以血糖为检测糖尿病的主要指标, 而 2型糖尿病临床前期症状隐匿, 从正常血糖到间歇餐后高血糖, 最后发展到持续性空腹高血糖, 从无糖尿到有糖尿, 从无症状到有症状、无并发症到有并发症, 一般要经历一段比较长的时间。目前关于糖尿病风险预警和早期诊断的方法和手段, 主要是根据种族、年龄、腰围、腰臀围比、血压、糖尿病家族史、饮食和运动习惯等制成危险因素计量表, 或根据口服葡萄糖耐量试验、餐后血糖、空腹胰岛素及糖化血红蛋白对糖尿病风险进行预测。新公布的2010年版《中国2型糖尿病防治指南》仍采用口服葡萄糖耐量试验对糖尿病前期人群进行筛查。因此, 利用现有临床检测手段很难对糖尿病进行早发现、早治疗。

2型糖尿病在发病进程中会出现糖脂代谢异常。大量研究表明, 其中HDL-C就是一个重要指标,50%的胰岛素抵抗的2型糖尿病患者和妊娠期糖尿病患者都存在 HDL-C水平显著降低(Ledet et al,1979; Bartha et al, 2000), 降低的HDL-C进而通过一系列的信号通路来降低 LDL-C对内皮介导的血管扩张作用的抑制(Matsuda et al, 1993), 故HDL-C具有抗动脉粥样硬化作用, 并与心血管疾病的发生呈负相关。HDL-C还可以保护β细胞免受胆固醇对其的损伤、应激引起的细胞凋亡和胰岛炎症的发生,从而可能作为一种药物来预防和治疗 T2DM(Kruit et al, 2010)。本研究虽然也统计发现在中老年食蟹猴群中随着血糖水平的升高, HDL-C水平有不断减低的趋势, 但却无统计意义上的显著差异(P＞0.05),而TCHO、LDL-C和TG无变化趋势和统计相关性,在正常波动范围内, 这说明了通过检测与糖尿病高度相关的传统临床检测指标, 也无法为2型糖尿病风险预警找到合适的参考指标。

外周血白细胞取材方便, 对机体无创伤性伤害,是一种理想的临床诊断材料。本研究所采用的荧光定量PCR方法具有较高的灵敏性, 一些在外周血白细胞中表达丰度较低的基因都被检测到, 这为进一步的研究这些基因在 T2DM 发病进程中的表达变化提供了有利的工具。本研究以传统临床检测指标——空腹血糖值为主要分组依据, 检测并分析了37个糖尿病相关基因在随机抽取的中老年食蟹猴中的表达与 FPG水平的相关性, 结果发现：ACE、ACLY、PRKCB1、SLC2A4、SNAP23、VAPA、IGF2BP2、IFNG等8个基因的表达水平随空腹血糖的升高而显著上调(P＜0.05)。这些基因在糖尿病的发生发展中都有着重要的作用(Vassilopoulos et al, 2009;Zeggini et al, 2007), 如 ATP柠檬酸裂解酶(ATP citrate lyase, ACLY)位于细胞质, 是糖代谢一关键基因, 依赖ATP将柠檬酸裂解为乙酰辅酶A。研究表明, ACLY活性水平对葡萄糖诱导胰岛素分泌有重要促进作用( MacDonald et al, 2009; Guay et al,2007), 在 T2DM 患者的胰岛中该酶活性和 mRNA水平较正常人显著减低(约 55%)(MacDonald et al,2009), 而在本研究中发现在食蟹猴血液样本中血糖高组该基因表达水平上调, 这是一个很有趣的现象, 可能与糖代谢紊乱时期、表达组织不同或人猴差异有关, 我们对该基因在糖尿病发病进程中的表达模式还在进一步的关注中。

本研究是对中老年食蟹猴群体的血液样本中37个糖尿病相关基因的表达状态进行的分子生物学调查。结果表明, 在传统生化指标难以对正常食蟹猴进行糖尿病风险评估时, 我们却可从个体的糖尿病相关基因的表达状态发现其潜在的糖尿病风险信息。如果这些信息与群体自发或诱发的糖尿病每一阶段结果相对应, 则可从中遴选出健康预期和糖尿病风险预警的部分候选指标。

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Expression status of diabetes-associated genes in middle and aged cynomolgus monkeys

ZHANG Xiu-Juan1, LI Xue-Jia1, XIA Ji-Liang1, YAN Sun-Xing2, JI Fang, ZHANG Yan-Chun,LIU Xiao-Ming1,2, PENG Bai-Lu1,2,*

(1.Guangdong Entomological Institute,Guangzhou510260,China; 2.GuangDong Landau Biotechnology Co.,LTD,Guangzhou510555,China)

A total of 138 middle and aged cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis) (above 10 years) were classified into three groups based on fasting plasma glucose (FPG) values, specifically low FPG, normal FPG, and high FPG group. Total cholesterol (TCHO), triglycerides (TG), high density lipoprotein cholesterol (HDL-C), and low density lipoprotein cholesterol (LDL-C) were detected in blood by automatic biochemical analyzer. The mRNA expressions of 37 diabetes-associated genes were analyzed with Real-time PCR in monocytes isolated from monkey peripheral blood. No significant correlation between the four serum lipid indictors HDL-C, LDL-C, TCHO, TG and FPG (P＞0.05) were found. However, the expressions ofACE,ACLY,PRKCB1,SLC2A4,SNAP23,VAPA,IGF2BP2, andIFNGwere significantly enhanced when FPG increased (P＜0.05).

Cynomolgus monkey; Serum Lipid; Peripheral blood leucocytes; Diabetes; Gene expression

R587.1; Q959.848; R-332

A

0254-5853-(2011)03-0300-07

10.3724/SP.J.1141.2011.03300

2011-02-17；接受日期：2011-04-19

国家“十二五”科技支撑计划研究项目(2011ZX093073-024)； 广州市重大科技专项项目(2010U1-E00811)；广东省自然科学基金项目（10451026001004520）

∗通讯作者(Corresponding author)，E-mail: pengbailu@hotmail.com

张秀娟(1979－)， 女， 研究方向：灵长类实验动物学； E-mail: hallen6424@tom.com