冯立芳, 畅 悦, 袁冬霞 缪 炜

(1. 中国科学院水生生物研究所 水生生物多样性与保护重点实验室, 湖北 武汉 430072;

2. 浙江工商大学 食品与生物工程学院, 浙江 杭州 310012; 3. 中国科学院研究生院, 北京 100049)

嗜热四膜虫五个hsp70基因的表达分析

冯立芳1,2, 畅 悦1,3, 袁冬霞1, 缪 炜1,*

(1. 中国科学院水生生物研究所 水生生物多样性与保护重点实验室, 湖北 武汉 430072;

2. 浙江工商大学 食品与生物工程学院, 浙江 杭州 310012; 3. 中国科学院研究生院, 北京 100049)

鉴定得到嗜热四膜虫13个含有完整保守结构域的hsp70基因, 对其中5个高度相似且无内含子的hsp70基因进行表达分析。在37 、39 和41 ℃热激条件下, 实时荧光定量PCR结果表明,hsp70-2基因对热激响应最敏感。在四膜虫生长、饥饿和接合生殖这3种生理或发育状态下, Microarray结果显示,hsp70-4基因恒定且高表达; 在热激条件下,hsp70-4基因的表达水平随着温度的升高而略微增加, 证实hsp70-4基因为热休克相关蛋白hsc70基因;克隆的hsp70-4基因全长2 208 bp, 开放阅读框长1 959 bp, 编码653个氨基酸。Microarray结果提示,hsp70-3可能参与四膜虫饥饿早期(0～12 h)的耐受和接合生殖后期(6～10 h)的新大小核形成, 老大核凋亡等事件;hsp70-5可能参与四膜虫饥饿晚期(12～15 h)的耐受和接合生殖早期(0～6 h)的小核减数分裂、小核交换和原核(pronuclear)融合事件。Blast2GO分析表明, 与hsp70-3和hsp70-5共表达的基因分别参与不同的生物学过程, 进一步反映了hsp70-3和hsp70-5这两个基因在功能上是存在差异的。

嗜热四膜虫;hsp70基因; 实时荧光定量PCR; Microarray; RACE; 表达分析

热休克蛋白(heat-shock protein, HSP)是生物适应环境变化的一个重要媒介分子, 温度、外源有毒化合物、紫外辐射等都会诱导细胞或机体产生应激反应, 迅速合成HSP作为分子伴侣参与蛋白质的合成、折叠、装配、运转和降解等过程, 以维持细胞蛋白自稳, 提高细胞对应激源的耐受性, 增强抗氧化作用, 使细胞维持正常的生理功能(Sørensen et al,2003; Saibil 2008)。热休克蛋白 70(HSP70)是 HSP家族的主要一员, 它是细胞在应激条件下的主要表达产物, 对于外源有毒化合物的响应也迅速而灵敏(Gupta et al, 2010)。根据表达情况,hsp70基因家族可分为两类：诱导型表达的hsp70基因(heat shock protein 70,hsp70)和组成型表达的hsp70基因(heat shock cognate gene,hsc70) (Karouna-Renier et al,2003; Sørensen et al, 2003)。对生物体hsp70基因家族的研究, 可以更好地认识物种耐受胁迫的机制(Daugaard et al, 2007), 这在单细胞生物, 如真菌Chytridiomycete (Blastocladiella emersonii) (Georg &Gomes, 2007); 多细胞动物, 如线虫Caenorhabditis elegans(Snutch et al, 1988)、果蝇Drosophila melanogaster(Bettencourt & Feder, 2001); 高等动物,如人(Daugaard et al, 2007); 植物, 如拟南芥Arabidopsis (Sung et al, 2001)等物种中已展开了研究, 但在原生动物中, 尚未有关hsp70基因家族或亚家族的相关报道。

原生动物四膜虫Tetrahymena隶属于纤毛门(Ciliophora)、寡膜纲(Oligohymenophorea)、膜口目(Hymenostomatida)、四膜虫科(Tetrahymenidae)、四膜虫属(Tetrahymena), 是一种营自由生活的单细胞真核生物(Shen, 1999)。目前, 嗜热四膜虫大核基因组测序工作 (TetrahymenaMacronuclear Genome Project) 已经完成(Eisen et al, 2006), 这为从基因组水平鉴定嗜热四膜虫内hsp70基因家族成员奠定了基础。此外, 近期构建的四膜虫的全基因组基因芯片分析平台(Miao et al, 2009)和在此基础上建立的四膜虫基因表达数据库(TetrahymenaGene Expression Database, TGED, http://tged.ihb.ac.cn),为嗜热四膜虫内hsp70基因家族成员的功能分析增加了丰富的信息。

关于四膜虫hsp70基因的研究主要在于不同热激条件下hsp70基因的表达变化规律(Galego &Rodrigues-Pousada, 1985; Williams & Nelsen, 1997),或是证实 HSP70赋予嗜热四膜虫的高温耐受能力(Hallberg et al, 1984, 1985), 或者是对hsp70基因上游调控元件的功能研究等方面(Barchetta et al,2008)。本研究在鉴定嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)hsp70基因家族的基础上, 对其中5个高度相似且无内含子的hsp70基因进行表达分析,并进一步探讨嗜热四膜虫hsp70基因的功能。

1 材料与方法

1.1 四膜虫细胞的培养

嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)(SB210株)由美国加州大学圣巴巴拉分校Eduardo Orias教授惠赠, 嗜热四膜虫(B2086株和CU428株)由美国康奈尔大学Peter Bruns教授惠赠。四膜虫的培养基组分：2% Proteose Peptone (Difco)、0.1% yeast extract(Oxide)、0.2% 葡萄糖(国药集团)、0.003%Ferric citrate(Sigma), 溶于双蒸水, 经 103 kPa、120 ℃灭菌20 min后冷却至室温。取长势良好的对数生长期四膜虫按总体积的 0.2% (400 μL)接种于20 ml培养基中, 30 ℃连续传代培养。

1.2 嗜热四膜虫hsp70基因的鉴定

在 5 μg/L浓度三丁基锡(Tributyltin, TBT)(Acros Organic)处理嗜热四膜虫CU428株24 h后,用 cDNA microarray筛选得到 1个应激响应基因hsp70 ——TTHERM_00125640 (Microarray数据未发表)。根据该基因的 ID号, 在四膜虫基因组数据库TGD(http://www.ciliate.org/)中进行搜索得到预测基因所编码的氨基酸序列。以此基因的氨基酸序列为基础, 并添加人、酵母和拟南芥的 HSP70序列,对四膜虫全基因组数据库进行Blastp搜索(Altschul et al, 1997); 得到的结果再次对四膜虫基因组进行Blastp搜索以找到四膜虫中所有的潜在hsp70基因。两次所得搜索结果在 NCBI的 CDD数据库——Conserved Domain Database (Marchler-Bauer et al,2009)以及Pfam数据库(Finn et al, 2010)中再次进行比对, 对具有 HSP70保守结构域的基因进行鉴定,最后总共得到了 13个具有完整保守结构域的嗜热四膜虫hsp70基因。将这13个hsp70基因的核酸预测序列与嗜热四膜虫转录组测序结果(数据未发表)进行比对校正。

1.3 序列比对及系统发育树的构建

对鉴定得到 13个hsp70基因, 使用 Muscle(Edgar,2004)和 Mafft(Katoh & Toh, 2008)进行序列比对, 并辅以手工微调。接着用 Trimal(Capella-Gutierrez et al, 2009)对gap超过80%的氨基酸比对位点进行删除。系统发育树用FastTree(Price et al,2010)构建, 参数设置-pseudo、-spr 4、-mlacc 2以及-slownni。我们对四膜虫系统发育树中一枝含有 5个高度相似且无内含子的基因进行分析, 并将它们分别命名为hsp70-1(TTHERM_01044390)、hsp70-2(TTHERM_00125640)、hsp70-3(TTHERM_01080440)、hsp70-4(TTHERM_00105110)、hsp70-5(TTHERM_00558440)。

1.4 热/冷激胁迫处理

温度胁迫采用热激和冷激两种方式, 每组设 3个平行样。热激处理条件为：将装有1 mL对数生长期嗜热四膜虫(SB210株)的离心管分别在37 ℃、39 ℃和41 ℃的水浴热激, 经过30 min热激诱导后于相应温度下离心富集虫体。冷激条件为：将装有1 mL对数生长期嗜热四膜虫(SB210株)的离心管分别在15 ℃水浴和0 ℃冰上冷激, 经过30 min冷激诱导后于相应温度下离心富集虫体。

1.5 RNA提取、cDNA合成、mRNA纯化、SMART cDNA文库构建、5'和3'RACE及产物克隆测序

从上述步骤(1.4节)热激处理条件下的嗜热四膜虫(SB210株)中提取总RNA, 提取方式参照试剂盒TRIzol Reagent (Invitrogen)的说明步骤, 总RNA最终溶于50 μL以DEPC处理过的双蒸水中, 分光光度计(Malcom)和琼脂糖凝胶电泳分别检测总RNA浓度和质量。总RNA反转录成cDNA的方法参见Feng & Miao(2008)。

将5 mL嗜热四膜虫(SB210株)在39 ℃热激1 h后提取总RNA, 接着以PolyAtract® mRNA纯化系统(Promega, Madison, WI)按照使用说明进行磁珠法纯化, 纯化后的mRNA使用SMART cDNA文库构建试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)扩增合成cDNA文库(Guo et al, 2010)。

根据步骤上述1.2节中鉴定得到的嗜热四膜虫hsp70基因序列, 设计扩增5个高度相似hsp70基因的实时荧光定量PCR引物; 根据SMART cDNA文库构建试剂盒提供的接头全长序列设计一对通用引物 UTR(表 1)。用正向通用引物与反向 hsp70-4引物扩增hsp70-4基因5'RACE序列, 用反向通用引物与正向hsp70-4引物扩增hsp70-4基因3'RACE序列：2.5 μL 10×buffer, 0.5 μL10 mmol/L dNTP(Fermentas), 0.4 μmol/L 引物, 1 unit Taq酶(BD advantage)混合, 0.5 μL文库cDNA模板, 最后用双蒸水配成25 μL RACE反应体系; RACE反应按照下列程序进行：94 ℃ 1 0 min预变性, 94 ℃ 3 0 s, 62℃30 s, 72 ℃ 1 min共35个循环反应, 最后于72 ℃延伸10 min。

PCR产物在 1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳后,特异DNA片段用glass milk胶回收试剂盒(Biostar,Canada)回收, 产物连接到 pGEM-T载体(Promega)多克隆位点, 之后转入大肠杆菌DH5α感受态细胞液中, 涂平板挑斑。筛选出的阳性克隆菌液交由上海联合基因研究院测序。

表1 RT-PCR扩增5个hsp70基因所使用的引物Tab. 1 Primer sequences used for RT-PCR amplification of 5 hsp70 genes

1.6 实时荧光定量PCR

以上述步骤1.5节中得到的总RNA反转录生成的 cDNA 为模板, 用表 1的 hsp70-1、hsp70-2、hsp70-3、hsp70-4、hsp70-5引物进行实时荧光定量PCR扩增, 内参基因选择嗜热四膜虫18SrRNA基因。实时荧光定量PCR反应体系：2.5 μL 10×buffer,0.5 μL 10 mmol/L dNTP, 0.4 μmol/L 引物, 1.2 μL EvaGreen (Biotium), 1 unit Hot start Taq 酶 (天为时代), 最后以双蒸水配成25 μL PCR反应体系。实时荧光定量PCR反应条件为：94 ℃ 5 min预变性, 中间40个循环的94 ℃ 10 s, 50 ℃ 10 s, 72 ℃ 20 s,70℃读板1 s, 接着72 ℃ 10 min延伸, 最后制作融解曲线65～90 ℃, 以0.5 ℃/s速率读取数据。每个样品设置3个平行样, 用Chromo4™实时荧光定量PCR扩增仪(Bio-Rad)进行扩增, 反应结果数据由程序 Opticon 2读取。基因的相对表达水平用软件Relative Expression Software Tool进行计算(Pfaffl et al, 2002)。统计方法采用软件自带的 ANOVA法,P＜0.05为有统计学意义。实时荧光定量 PCR分析方法参考Feng et al (2007)。

1.7 共表达基因分析

根据嗜热四膜虫3种典型生理/发育状态(生长、饥饿和接合生殖)20个阶段的全基因组基因表达数据(数据来源于 TGED), 通过计算所有基因表达谱间的相关系数分别得到了四膜虫hsp70-3和hsp70-5基因的共表达基因(相关系数＞0.9) (Miao et al,2009)。然后对找到的候选基因用 Blast2GO进行gene ontology (GO)术语(term)的注释, 分析共表达基因之间的关系, 进而推测hsp70-3和hsp70-5基因的功能。

2 结 果

2.1 嗜热四膜虫hsp70基因的鉴定与系统发育分析

在TBT胁迫条件下用Microarray筛选到一个应激响应基因hsp70(TTHERM_00125640), Microarray信号显示其表达上调4.4倍。以该预测hsp70基因所编码的氨基酸序列为基础, 经 blast比对共得到13个含有完整保守结构域的嗜热四膜虫hsp70基因,进一步结合嗜热四膜虫转录组测序结果(数据未发表)对这 13个基因的剪接位点和核酸序列进行校正。

对鉴定得到的13个嗜热四膜虫hsp70基因构建系统发育树, 结果显示有5个hsp70基因聚成一个小的进化枝(图 1), 这 5个hsp70基因均无内含子,由它们推导的氨基酸序列比对如图2所示, 两两之间的相似度为67.5%～76%。

图1 最大似然法构建的嗜热四膜虫hsp70基因家族不同基因型的系统发育树Fig. 1 Phylogenetic tree of Tetrahymena thermophila hsp70 gene family members using a ML method

2.2 热激条件下5个hsp70基因的表达水平变化

在37 ℃、39 ℃、41 ℃热激条件下,hsp70-1、hsp70-2、hsp70-3、hsp70-4、hsp70-5这5个基因的表达水平高于正常生长时期的 30 ℃(图 3)。除hsp70-4外, 其余4个hsp70基因的表达水平并不随着温度的升高而增加, 在 41 ℃时它们的表达水平要低于39 ℃。在37、39、41 ℃这3个不同热激条件下,hsp70-2对热激响应最敏感, 其表达水平在5个hsp70基因中是最高的, 分别比对照组30 ℃时的表达水平高12、82和15倍。

2.3 冷激条件下5个hsp70基因的表达水平变化

以四膜虫正常生长条件 30 ℃为对照, 分别以15 ℃和0 ℃冷激作为刺激条件, 对5个hsp70基因的表达水平进行考察。结果显示, 除hsp70-4外, 其余4个hsp70基因对冷激都不响应(结果未显示)。在不同的冷激条件下,hsp70-4基因的表达水平呈现为截然不同的规律：在15 ℃冷激30 min后hsp70-4表达水平提高了1倍, 但是在0 ℃冷激30 min后hsp70-4表达水平却降低了50%(图4)。

2.4 3种四膜虫典型生理/发育时期下5个hsp70基因的表达水平变化

根据四膜虫基因表达数据库(Tetrahymenagene expression database, TGED, http://tged.ihb.ac.cn)提供的四膜虫在 3种典型生理/发育时期下的基因表达情况, 可将5个hsp70基因分为两大类：(1) 恒定且高表达的基因,hsp70-4基因在四膜虫生长、饥饿及接合生殖时期表达稳定且表达量非常高,Microarray信号值在32 815～61 446之间; (2) 差异表达的基因, 为hsp70-1、hsp70-2、hsp70-3、hsp70-5这4个基因：① 在生长时期,hsp70-3的信号值在141～209, 有较低的表达水平, 而hsp70-1、hsp70-2、hsp70-5这 3个基因不表达(信号值＜100); ② 在饥饿时期的0 h,hsp70-1、hsp70-2、hsp70-3这3个基因表达量较生长后期(～1×106cells/mL)分别调高42.6、15、33.6倍, 其中hsp70-3基因的信号值最高,为7 022; 在饥饿时期的0～12 h,hsp70-1、hsp70-2、hsp70-3表达水平的变化趋势由高至低,hsp70-5几乎不表达; 在饥饿时期的12～15 h,hsp70-5表达水平上调, 而hsp70-1、hsp70-2、hsp70-3的表达水平仍持续下降; 在饥饿时期的 15～24 h,hsp70-1、hsp70-2、hsp70-3、hsp70-5这4个基因的表达都下降; ③ 在接合生殖时期的0～6 h, 仅hsp70-5高表达;在接合生殖时期的6～10 h,hsp70-5表达水平下降了80%,hsp70-3表达水平迅速上调16.6倍,hsp70-2表达水平上调 2.4倍; 在接合生殖时期的 10～12 h,hsp70-3表达水平下降了68.75%, 但hsp70-2表达水平持续上调 2.4倍; 在接合生殖时期的 12～18 h,hsp70-2表达水平下降了81.8%,hsp70-1表达水平上调2.1倍(图5)。

图2 5个hsp70基因推导的氨基酸序列比对Fig. 2 Multiple sequence alignment of the HSP70

2.5 嗜热四膜虫hsc70基因的克隆

嗜热四膜虫hsp70-4基因在四膜虫的正常生长条件下即高表达, 而且热激后其表达量进一步提高,属于典型的热休克相关蛋白hsc70基因。从嗜热四膜虫全长 cDNA文库中克隆了hsc70基因的全长 cDNA,hsc70无内含子, 其开放阅读框长2 208 bp, 编码653个氨基酸, 5'和3'非翻译区分别为94 bp和155 bp; 在3'非编码区存在纤毛虫特有终止信号(ATTTA和AATTAA) (Boldrin et al, 2003) (图6)。

2.6 共表达基因分析

计算得到与嗜热四膜虫hsp70-3和hsp70-5共表达的基因分别有18个和392个, 用Blast2GO对它们的功能进行注释, annotation结果分别成功得到10个(55.6%)和165个(42.1%)与GO terms相关的基因, 它们所参与的生物学过程分别有16种和113种,其中有8种生物学过程是重叠的(图7)。

图3 实时荧光定量PCR比较嗜热四膜虫5个hsp70基因在亚致死热激条件下(37、39及41℃)的表达水平变化Fig. 3 Comparative expression analysis of 5 hsp70 genes inTetrahymena thermophila treated with heat shock (37,39, and 41℃) using real time quantative PCR

图4 实时荧光定量PCR考察嗜热四膜虫hsp70-4基因在冷激条件下(15 ℃与0 ℃)的表达水平变化Fig. 4 Comparative expression analysis of hsp70-4 genes in Tetrahymena thermophila treated with cold shock(15℃ and 0 ℃) using real time quantative PCR

3 讨 论

3.1 嗜热四膜虫内存在五个结构高度相似的hsp70基因

图5 5个hsp70基因的表达谱Fig. 5 Expression profile of 5 hsp70 gene

图6 嗜热四膜虫hsc70基因的cDNA序列及推导的氨基酸序列Fig. 6 The cDNA and deduced amino acid sequence of Tetrahymena thermophila hsc70 gene

图7 维恩氏图显示与hsp70-3和hsp70-5共表达基因所参与的生物学过程比较Fig.7 Venn-Diagram showing the comparison of biological processes between the co-expressed genes with hsp70-3 and hsp70-5

热休克蛋白HSP70在细胞中行使多种功能, 包括蛋白折叠、多聚体的耦合与解离、蛋白跨膜定位、热激响应等, 为顺利实现上述功能, 真核细胞的基因组往往编码多个HSP70蛋白(Lindquist & Craig,1998)。目前在人(Daugaard et al, 2007)、果蝇(Drosophila melanogaster)(Bettencourt & Feder,2001)、线虫(Caenorhabditis elegans)(Snutch et al,1988)、拟南芥Arabidopsis (Sung et al, 2001)、真菌Chytridiomycete(Blastocladiella emersonii) (Georg &Gomes, 2007)等中均已鉴定到由多个hsp70成员组成的基因家族。但是有关原生动物hsp70基因家族或亚家族的信息匮乏, 尤其是模式生物四膜虫中,在大核基因组测序工作完成前仅对个别hsp70的功能进行分析(Hallberg et al, 1984; Galego & Rodrigues-Pousada, 1985; Williams & Nelsen, 1997; Barchetta et al, 2008)。

本研究鉴定得到了 13个具有完整保守结构域的嗜热四膜虫hsp70基因, 系统发育分析表明, 其中有5个基因聚成一个小的进化枝(图1)。推测这5个基因可能来源于基因的近期复制事件, 类似于四膜虫内已发现的其它基因家族的进化方式(Fu et al,2009)。真核生物细胞质中的HSP70末端4个氨基酸组成高度保守, 无论是植物, 如拟南芥, 或是低等生物, 如果蝇, 还是高等动物, 如大鼠、牛、人等均由 EEVD组成, 以维持 mRNA的转录顺利完成(Kiang & Tsokos, 1998; Chou et al, 2003)。但在嗜热四膜虫内这5个高度相似的HSP70末端4个氨基酸组成却为 DEVD, 亦不同于原核生物E. Coli的EEVKDKK, 推测四膜虫内HSP70成员的具体功能可能有别于其它真核生物。进一步对这5个hsp70基因推导的氨基酸序列进行比对, 发现N端相对分子质量为 44 kDa的 ATPase功能域(ATP-binding domain)的序列几乎一致, 而 C端相对分子质量为18 kDa的多肽结合功能域 (polypeptide-binding domain) 和相对分子质量为10 kDa 的C端结构域(C-terminal domain)的相似度则稍低(图2)。作为行使 ATP水解活性区域的 ATPase功能域(Kiang &Tsokos, 1998), 5个HSP70蛋白序列的高度保守, 推测它们可能都具有水解ATP的功能; 而行使HSP70定位的C端相对分子质量为18 kDa的多肽结合功能域 (Wang et al, 1993; Demand et al, 1998)在5个HSP70蛋白序列中差异较大, 尤其是起自偶联作用的相对分子质量为10 kDa的C端结构域(Chou et al,2003)差异更大, 说明这5个蛋白在四膜虫细胞内行使的具体功能可能是有所差异的。

3.2 hsp70-2对热激响应最敏感

之前的研究表明, 嗜热四膜虫在41 ℃热激15 min后即可检测到hsp70基因的表达产物, 在41 ℃热激1 h后HSP70蛋白表达量趋于稳定(Williams &Nelsen, 1997; Hallberg et al, 1985); 但是,hsp70-1至hsp70-5这5个基因的mRNA表达水平在15～30 min达到最高值, 在 1 h后其表达量反而下降(Dr.Sabrina Barchetta, personal communication)。因此,本研究采用热激30 min来研究上述5个hsp70基因的表达水平。

在37 ℃、39 ℃、41 ℃热激条件下, 5个hsp70基因的表达水平均高于正常生长时期的 30 ℃, 其中以hsp70-2基因的表达水平为最高。推测嗜热四膜虫对热激的响应主要依赖于hsp70-2基因, 其它4个hsp70基因起到辅助作用。这在酵母胞质hsp70基因——Ssa亚家族中已有类似的系统研究,Ssa亚家族的成员之间功能虽然有重叠, 但是每个 Ssa蛋白只在特定条件下行使功能, 其它成员只是起补偿作用(Craig et al, 1993)。嗜热四膜虫(T. thermophila)是一种迄今为止所有已知四膜虫属内耐热能力最高的物种(Nanney & Simon, 2000)。如实验室常用的梨形四膜虫(T. pyriformis)在32 ℃即无法繁殖生存,而嗜热四膜虫在40 ℃时仍能很好地存活(Frankel &Nelsen, 2001)。推测,hsp70-2基因在嗜热四膜虫具有高耐热能力中可能起到主要作用。

3.3 鉴定得到的hsp70-4是一个热休克相关蛋白基因

在以15 ℃和0 ℃冷激条件下, 仅hsp70-4对冷激有响应, 其余4个hsp70基因的mRNA表达产物均检测不到, 说明并不是所用的嗜热四膜虫hsp70基因对冷激有响应。在果蝇中也同样如此,hsp70Aa对冷激响应最敏感, 而hsp60、hsp67Ba、hsc70-1这3个基因在冷激条件下无表达产物(Colinet et al, 2010)。

考察四膜虫在 3种典型生理/发育时期下的hsp70基因表达情况, 发现hsp70-4基因在四膜虫的生长、饥饿及接合生殖时期表达稳定, 表达量非常高; 此外, 在 37 ℃、39 ℃、41 ℃热激条件下,hsp70-4的表达水平随温度的升高而进一步提高,据此认为该基因属于典型的组成型表达的热休克蛋白(Karouna-Renier et al, 2003; Sørensen et al,2003), 也称为热休克相关蛋白(heat shock cognate protein, hsc)。这是迄今为止在四膜虫内发现的首个hsc70。而hsp70-1、hsp70-2、hsp70-3、hsp70-5这4个基因在生长时期表达量低或不表达, 在热激条件下诱导高表达, 属于诱导型表达的热休克蛋白。

3.4 hsp70-3与hsp70-5在四膜虫生理/发育状态下

行使不同的功能

在四膜虫的饥饿初期0 h,hsp70-1、hsp70-2、hsp70-3这 3个基因的表达量迅速调高, 其中以hsp70-3基因的信号值最高, 而hsp70-5却不表达;随着饥饿时间的延长, 在 12～15 h的饥饿阶段,hsp70-5的表达量才开始上升, 但此时hsp70-1、hsp70-2、hsp70-3的表达量都已经明显下降。这说明饥饿处理会诱导四膜虫hsp70基因的表达。这与在其它生物体内发现的现象是一致的, 无论是单细胞生物, 如酵母, 还是脊椎动物, 如露斯塔野鲮鱼(Labeo rohita), 饥饿导致它们体内的hsp70基因表达上调(Chughtai et al, 2001; Yengkokpam et al,2008)。另一点值得注意的是, 不同的饥饿时间段对应不同的hsp70基因表达, 0～12 h主要是hsp70-3起表达, 12～15 h则是hsp70-5在表达, 提示hsp70-3和hsp70-5这两个基因在功能上是有差异的。

Hsp70基因不仅可以被热激、饥饿等所诱导表达, 而且也会在发育时期表达, 真菌(B. emersonii)的hsp70基因即属于此类(Bonato et al, 1987)。在四膜虫接合生殖时期,hsp70-1、hsp70-2、hsp70-3、hsp70-5的表达均发生变化, 其中hsp70-3和hsp70-5的表达水平最高, 变化最明显。在接合生殖时期的0～6 h, 以hsp70-5表达为主, 此阶段四膜虫细胞内的小核通过有丝分裂产生单倍体小核, 并发生小核交换和原核(pronuclear)融合事件; 在 6～10 h,hsp70-5表达水平下降, 而hsp70-3表达水平迅速上调, 此阶段四膜虫细胞内的融合核发育成新的大核和新的小核, 老大核凋亡(Cole et al, 1997; Cole &Soelter, 1997)。

根据嗜热四膜虫3种典型生理/发育状态(生长、饥饿和接合生殖)20个阶段的全基因组基因表达数据, 计算得到与hsp70-3共表达的基因有18个, 其中10个是与GO terms相关的基因, 参与16种生物学过程; 与hsp70-5共表达的基因有 392个, 其中165个是与GO terms相关的基因, 参与113种生物学过程。对这两类基因各自所参与的生物学过程进行比较, 发现其中有8种过程是重叠的, 涉及DNA代谢、DNA修复、翻译后蛋白修饰、蛋白修饰、胞内蛋白运输、离子运输、磷酸化、羧酸代谢过程等,这些生物学过程可能与四膜虫受饥饿胁迫或接合生殖时期细胞分化、发育是相关的。进一步对这两类基因有差异的生物学过程进行比较, 发现与hsp70-3共表达的基因主要参与脂肪酸氧化、脂肪酸代谢、脂肪酸分解、羧酸分解、脂修饰、脂氧化、细胞脂肪分解等过程; 而与hsp70-5共表达的基因则主要参与细胞周期检验点控制、细胞形态发生、有丝分裂中期板汇集、有丝分裂M期、减数分裂、RNA代谢、RNA分解、mRNA代谢等过程。上述结果显示hsp70-3和hsp70-5在饥饿和接合生殖阶段的表达谱显著不同, 以及与它们共表达基因所参与的生物学过程亦存在差异, 说明hsp70-3和hsp70-5这两个基因在功能上是存在差异的。

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Expression analysis of 5hsp70genes inTetrahymena thermophila

FENG Li-Fang1,2, CHANG Yue1,3, YUAN Dong-Xia1, MIAO Wei1,*

(1. Key Laboratory of Aquatic Biodiversity and Conservation,Institute of Hydrobiology,theChinese Academy of Sciences,Wuhan430072,China;
2.College of Food Science and Biotechnology,Zhejiang Gongshang University,Hangzhou310035,China;3.Graduate School of the Chinese Academy of Sciences,Beijing100049,China)

Thirteenhsp70genes with complete conserved domains were identified inTetrahymena thermophila, and expression of five similar and non-intronhsp70genes were analyzed. Under heat shock conditions of 37, 39 and 41ºC,hsp70-2mRNA had the highest relative expression level, suggesting it is closely related to heat shock. The basal level of constitutiveT. thermophilahsp70-4gene was high during 20 physiological/developmental stages of growth, starvation and conjugation, and it changed little upon exposure to heat shock: evidence thathsp70-4is an hsc70 gene. Thehsp70-4cDNA is 2 208 bp long, and contains an open reading frame of 1 959 bp encoding 635 amino acids. Microarray data indicated thatT. thermophilahsp70-3gene probably participated in early starvation (0–12 h) stress and late conjugation(6–10 h) events, such as new macronuclear and micronuclear anlagen formation and old macronuclear elimination.However,hsp70-5gene possibly participates in late starvation (12–15 h) stress and early conjugation (0–6 h) events such as micronuclear meiosis, micronuclear exchange and pronuclear fusion. Blast2GO indicated that they participated in dissimilar biological processes, suggestinghsp70-3andhsp70-5perform different functions.

Tetrahymena thermophila; Real time quantitative PCR; Microarray; RACE; Expression analysis

Q959.117; Q786

A

0254-5853-(2011)03-0267-10

10.3724/SP.J.1141.2011.03267

2010-10-13；接受日期：2011-02-22

中国科学院知识创新项目(KSCX2-EW-G-6-4); 国家自然基金资助项目(31071993)∗

Corresponding author)，E-mail: miaowei@ihb.ac.cn; miaowei530@yeah.net