张敏,张金泽,段素芳,高加涛,王雪

(中国食品发酵工业研究院,北京,100027)

微生物发酵生产水苏糖培养基的优化＊

张敏,张金泽,段素芳,高加涛,王雪

(中国食品发酵工业研究院,北京,100027)

通过 Plackett-Burman设计和响应面分析对微生物发酵提纯水苏糖的培养基进行了优化。通过 Plackett-Burman设计从 6个因素中筛选出了有显著影响的酵母浸膏、酪蛋白胨和硝酸钠 3个因素;通过最陡爬坡和 Boxbohnken设计进一步优化,并利用Minitab软件进行回归分析,得到以上 3个因素的适宜浓度分别为 (g/L):酵母膏 13.8、酪蛋白胨 8.2、硝酸钠 4.8。采用优化的培养基下,水苏糖纯度由 85%提高到 91%。

响应面法,发酵,提纯,水苏糖

水苏糖是唇形科水苏属植物中天然存在的能显著促进人体肠道有益菌群增殖的功能性低聚糖,被誉为“天然超强双歧因子”[1]。水苏糖还可以间接的增加B族维生素的合成量,降低血液中的胆固醇含量,并使人体免疫性能得到改善,对防治便秘、保肝护肝、调节人体代谢等有重要保健作用[2-5]。水苏糖从我国特有传统蔬菜草石蚕等植物中提取,具有绿色健康、使用量低等优点,市场发展前景广阔。因此,近年来水苏糖的提取研究受到广泛的关注。与传统的物理提取工艺相比,采用发酵法从天然植物中直接提纯水苏糖,针对微生物对不同糖源利用的特殊性,接种特定的菌种,水苏糖纯度可由 74%升至 85%左右。在已筛选出符合实验条件的菌株和确定了培养条件的基础上[6],本文采用响应面法[7-8]对其发酵培养基进一步优化,以期进一步提高水苏糖纯度。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

乳酸菌:保加利亚乳杆菌 (Lb.bulgaricus)、嗜热链球菌 (Str.ther m ophilus)(活菌数 >109个 /g),实验室自配菌粉;日本曲霉 (Aspergillus japonicas):购自CICC。

1.1.2 培养基

日本曲霉种子培养基,PDA培养基;初始发酵培养基 (g/L):酵母浸膏 10;酪蛋白胨 5;硝酸钠 5;K2HPO4 2;MgSO4·7H2O 0.2;CaCO32,溶于草石蚕浸提液 1 000 mL,pH自然。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基的优化设计

1.2.1.1 Plackett-Burman设计

通过单因素试验发现,影响水苏糖纯度的主要因素有:酵母浸膏、酪蛋白胨、硝酸钠、K2HPO4、MgSO4·7H2O、CaCO3。用 Plackett-Bur man设计对以上 6个因素进行全面考察,选用 N=12的 P-B设计,如表 1和表 2所示,X7～X10为 4个空项设计,用来估计实验误差。试验结果用Minitab软件进行数据分析。

表1 Plackett-Burman试验水平

表2 Plackett-Burman试验设计

1.2.1.2 最陡爬坡试验接近最大响应面区域

根据 P-B试验分析的结果筛选出影响水苏糖纯度的显著因素,并以各显著因素的正负效应确定下一步试验的最陡爬坡路径 (包括变化方向和变化步长),快速的逼近最佳区域。试验设计见表 3。

表3 最陡爬坡试验设计 g/L-1

1.2.1.3 响应面试验设计

通过 P-B试验确定出影响水苏糖纯度的主要因素,进而由最陡爬坡实验确定接近响应值区域显著因素的浓度,利用 Box-Bohnken设计进一步优化,其设计见表 4和表 5。每个因素有 3个水平,在中心点上有 3个重复,以水苏糖纯度为响应值 Y,试验数据用Minatab软件进行多项式回归分析,通过回归拟合后得到一个试验因子对响应值影响的二阶经验模型

式中:Y为预测响应值即水苏糖纯度,β为回归系数,xi为自变量的编码水平,它与自变量 Xi之间的关系是:xi=(Xi-Xi0)/ΔXi其中,Xi0为实验中心点处的自变量值,ΔXi为自变量的变化步长。

表4 Box-Behnke试验因素水平

表5 Box-Behnke试验设计

1.2.2 培养条件

草石蚕浸提液浓度为 9°Brix,每升培养基中添加孢子浓度为 2×108个 /mL的日本曲霉菌悬液 20 mL和 2 g乳酸菌干粉,放入 28℃恒温箱中静置培养 48 h后,转移至 37℃恒温箱静置培养 24 h。

1.2.3 水苏糖纯度的测定

发酵结束后,取 50 mL糖液,加 0.1 g活性炭对糖液进行脱色,加热保持至 80℃左右搅拌 30 min,趁热过滤,滤液稀释至折光为 2.0后,经 0.22μm的微孔滤膜过滤得到待分析糖液,然后用 HPLC法对糖液进行检测。HPLC的色谱条件为:示差检测器:岛津公司 LC10-AT;流动相真空抽滤脱气装置及0.22μm微孔膜;色谱柱:氨基键合柱:Hypersil-NH2(大连依利特公司);填料粒径:5μm;柱尺寸:Φ4.6 mm ×250 mm(大连依利特公司);柱温:30℃;微量进样器:25μL;流动相 ∶V(乙腈 ) ∶V(水 )=70∶30;进样量为10μL。

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman设计筛选影响水苏糖纯度的主要因素

根据单因素试验选取对水苏糖纯度有影响的 6个因素,每个因素选高低 2个水平,以水苏糖纯度为响应值 (Y),X7～X10为 4个空项设计,用来估计试验误差。试验设计及结果如表 6(每组试验有 3个重复,以平均值为准)所示。分别计算个因素效应,并进行重要性评价,结果见表 7。

由表 7可知,发酵液培养基组分中对最终水苏糖纯度有显著影响 (可信度 >95%)的因素包括酵母膏,酪蛋白胨及硝酸钠。其中,酵母膏和酪蛋白胨有显著正效应,硝酸钠有显著负效应。因此,后面的试验主要考察这 3个因素,且应适当增加酪蛋白胨和酵母膏的含量,减少硝酸钠的含量。

2.2 最陡爬坡试验接近最大响应面区域

从表 7可知,在影响水苏糖纯度的各主要培养基组分中,酵母膏和酪蛋白胨有显著正效应,硝酸钠有显著负效应。根据这 3个因素效应大小的比例设定它们的变化方向和步长,其他各因素分别取各自的低水平进行试验,试验设计及结果见表 8。

表8可知,随着 3个重要因素的不同变化,糖液中水苏糖纯度的变化趋势是先上升后下降,其中第四组培养基组分对应的水苏糖纯度最高,响应变量接近最大响应区域,所以以第四组条件为中心点进行响应面分析。

表6 Plackett-Burman试验设计及结果

表7 Plackett-Burman试验水平及其主效应分析

表8最陡爬坡试验设计及结果

2.3 Box-Behnke试验设计筛选重要因素的最优水平

以酵母膏,酪蛋白胨及硝酸钠 3个重要因素为自变量,各因素编码水平如表 4所示。Box-Behnke试验设计及试验结果如表 9所示。

表9 Box-Behnke试验设计及结果

以水苏糖纯度为响应值,利用Minitab软件对表9的结果进行回归拟和,得到二阶回归方程为:Y=90.700 0+0.42X1+1.237 59X2+0.237 5X3-0.55X2-1.325X2- 1.325X2+ 0.425XX-123120.075X1X3-0.85X2X3此数学模型的方差分析结果如表 1 0所示,相关系数达到 0.94,说明模型对实际情况的拟和较好。因此可用回归方程对最佳培养基组分进行预测。

表10 回归方程的方差分析

2.4 响应面分析及最佳培养成分确定

利用Minitab软件对回归模型进行响应面分析,得到各响应面立体分析图及等值线图,见图 1～图 6。

由图 1和图 2可以看出,水苏糖纯度随着酵母膏含量的增加其变化趋势在酪蛋白胨浓度为 5～8 g/L时不明显,在酪蛋白胨浓度为 8～9 g/L时随酵母膏含量增加而增加。在酵母膏含量不变的情况下,水苏糖纯度随着酪蛋白胨含量的增加先增加后减少,且增加速度快而减少速度较慢。

图 2 Y=f(X1,X2)的等高线图

图 3 Y=f(X1,X3)的响应面图

图 4 Y=f(X1,X3)的等高线图

由图 3和图 4可以看出,在硝酸钠含量不变的情况下,水苏糖纯度随着酵母膏浓度的增加变化趋势不明显,在低酵母膏浓度范围内 (9～11.25 g/L)随着酵母膏的增加有增高变化,高酵母膏浓度范围内几乎没有变化。在酵母膏含量不变的情况下,水苏糖纯度随着硝酸钠浓度的增加先增加后减少,且增加速度快而减少速度较慢。

由图 5和图 6可以看出,在硝酸钠浓度为 3～7 g/L内,水苏糖纯度随着酪蛋白胨浓度增加而增加。在酪蛋白胨浓度含量不变的情况下,水苏糖纯度随着硝酸钠浓度的增加先增加后减少,酪蛋白胨浓度越高变化趋势越不明显。

综合分析图 1～图 6,酵母膏、酪蛋白胨和硝酸钠均对发酵液中水苏糖纯度有显著的影响,其中酪蛋白胨的作用最为显著。三者之间均存在交互影响作用,与方差分析结果一致。

由图及软件分析可知,回归方程存在稳定点。通过响应优化器分析知 Y的最大值出现在 X1、X2、X3的编码值分别为 (0.6162,0.5960,-0.1111),即酵母膏、酪蛋白胨和硝酸钠的最佳浓度分别为 (g/L):13.8、8.2、4.8,此时 Y达到最大值为 91.2。以此浓度配置发酵培养基,分批次发酵进行试验验证,得到水苏糖纯度均值为 91.0,这与预测值是基本吻合的。

图 5 Y=f(X2,X3)的响应面图

图 6 Y=f(X2,X3)的等高线图

3 结论

本文通过 Plackett-Burman设计和 Box-Behnke试验及响应面分析,确定了发酵液所用培养基的浓度,酵母膏、酪蛋白胨、硝酸钠、K2HPO4、碳酸钙、MgSO4·7H2O的最佳浓度分别为 (g/L):13.8、8.2、4.8、1、1、0.1。综合以上工艺参数对草石蚕浸提液进行发酵,得到的糖液中水苏糖纯度可达到 91%、单双糖含量在 3%左右,水苏糖保留率大于 95%。在此优化培养基下,比优化前纯度提高了 6%。

[1] 郑建仙,功能性低聚糖,北京:化学工业出版社,2004.

[2] Pan B,Li d,et al.Effect of dietary supplementation with alpha-galactosidase preparation and stachyose on growth performance,nutrient degestibility and intestinal bacterial populations of piglets[J].Arch Tierernahr,2002,56(5):327-337.

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[4] 程书权,孔淑敏,中草药活性成分治疗慢性肝病的现代研究[J].国外医学中医中药分册,2004,26(4):211.

[5] 任宏强,水苏糖[J].精细与专用化学品,2002,14:15-17.

[6] 王雪,张金泽,水苏糖发酵提纯菌株的筛选研究[J].食品发酵与工业,2010,(10):94-97.

[7] Dale B McDonald,Walter J Grantham,WayneL Tabor,et al.Global and localoptimization using radial basis function response surface models[J].Applide MsthematicalModelling,2007,31:2 095-2 110.

[8] Montgomery D C.Design and Analysis of Experiments(3rd ed)[M].New York:JohnW iley&Sons,1991.

M edium Optim ization by Response Surface M ethodology for Purification of Stachyose by Fermentation

ZhangMin,Zhang Jin-ze,Duan Su-fang,Gao Jia-tao,Wang Xue
(Institution of China National Research Institute of Food&Fe rmentation Industries,Beijing 100027,China)

By using Plackett-Burman and response surface methodology,we studied the medium opti mization of purification of stachyose by fer mentation.A Plackett-Burman design was first used to evaluate the influence of six related factors,and yeast extract,casein peptone,NaNO3were affir med the important factors in the medium,and then the path of steepest ascent and the Box-Behnken design were used for further optimization on these three factors.By solving the quardratic regression model equation,the optimal concentrationsof the variableswere determined as:yeast extract1.38%,casein peptone 0.82%,NaNO30.48%.Under the optimal culture condition,the purity of the stachyose increased from 85%to 91%.

response surface methodology,fermentation,purification,stachyose

硕士研究生 (张金泽教授级高级工程师为通讯作者)。

＊国家高技术研究发展计划(2007AA10Z335)

2010-02-11,改回日期:2011-02-12