林智恺 综述;束 蓉，宋忠臣 审校

(上海交通大学医学院附属第九人民医院·口腔医学院牙周科，上海市口腔医学研究所，上海 200011)

重组釉原蛋白的研究进展

林智恺 综述;束 蓉，宋忠臣 审校

(上海交通大学医学院附属第九人民医院·口腔医学院牙周科，上海市口腔医学研究所，上海 200011)

重组釉原蛋白(recombinant amelogenin，rAm)是通过生物工程技术得到的一类纯化蛋白，许多研究结果证实其可以促进牙周组织再生。而目前对于rAm的结构功能和促进牙周组织再生的具体机制尚不完全清楚，因此近年来有许多关于rAm各方面的研究。该文从rAm的分类、表达纯化、结构及其对牙周组织再生的促进作用和机制等方面的研究进展作一综述。

重组釉原蛋白;牙周组织再生;结构;功能

［牙体牙髓牙周病学杂志，2011，21(1):48］

［Chinese Journal of Conservativedentistry，2011，21(1):48］

牙周炎病人缺失的牙周组织再生一直是牙周治疗的难点和重点，自从20世纪70年代发现釉基质蛋白(enamel matrix proteins，EMPs)可诱导牙骨质形成以来，对牙周组织再生的诱导作用日益受到关注，并进行了大量研究。EMPs中的主要成分包括:釉原蛋白(amelogenin，Am)、釉蛋白(enamelin)、釉丛蛋白(tuftlin)等，其中Am是EMPs促进牙周组织再生的主要活性成分，含量约占EMPs的90%左右。有学者通过乙酸法［1］从6月龄猪发育期的牙胚中提取了EMPs，经纯化冻干后可得到釉基质衍生物(enamel matrixderivative，EMD)。国外已有商品化生产的猪基质蛋白衍生物emdogain®，它是一种混合蛋白，具体成分还不清楚，其中90%以上为猪釉原蛋白，并可能含有骨形成蛋白样生长因子［2］，但不含釉蛋白、釉丛蛋白等［3］。现已有大量体内外实验和临床试验证明:在牙周炎治疗中应用emdogain®可以促进牙周组织再生。

猪釉基质蛋白衍生物因获取困难，成本高昂，每次提取产量有限，而且不是纯净的釉原蛋白等缺点。近年来通过基因工程学和生物工程技术，克隆釉原蛋白的成熟肽编码区基因，再构建表达载体，表达并分离纯化，可得到单一组分重组釉原蛋白(recombinant amelogenin，rAm)，具有来源广泛，性质稳定，能批量纯化获得等优点，近年来，已有大量与rAm相关的研究报道。本文就rAm分类、表达纯化、结构组成、对牙周组织再生的作用和机制等几个方面作一综述。

1 rAm的分类

通过重组得到的rAm按种属来源主要有以下几类:重组人釉原蛋白(recombinant human amelogenin rHAm)，例如含有175个氨基酸的 rH175等［4］，重组猪釉原蛋白(recombinant porcine amelogenin rPAm)，例如含有172个氨基酸的rP172等，重组鼠釉原蛋白(recombinant murine amelogenins rMAm)，例如不含组氨酸标记的rM179和含有组氨酸标记的rp(H)M180等［5］。按照rAm的分子量可分为:25×103全长重组釉原蛋白(full－length recombinant amelogenin)，20×103亲水C端24个氨基酸被降解的重组釉原蛋白降解片段［6］。最近，有研究者还重组了一些低分子量釉原蛋白A+4(包含外显子 2、3、4、5、6、7d)、A －4 又称富亮氨酸釉原蛋白片段(leucine－rich amelogenin peptide，LRAP，包含外显子2、3、5、6、7d)和5 ×103富酪氨酸釉原蛋白片段 (tyrosine－rich amelogenin peptide，TRAP)等，有研究表明他们可能起细胞信号分子的作用［7］。

2 rAm的表达和纯化

rAm常用的表达纯化体系主要有两类:一类为原核表达体系，该类体系应用已近二十余年，通过不断改进和完善，已比较成熟，可以得到较稳定的产量。其基本途径为利用限制性内切酶将rAm的cDNA插入原核表达载体(质粒)，再将重组完成的质粒转化到大肠埃希菌中(Escherichia coli)，使之成为表达rAm蛋白的工程菌，诱导表达得到融合的rAm;最后通过亲和层析纯化，收集纯化的rAm［8］。另一类为真核表达体系，这是一类比较新，而且研究报道较少的表达体系。Taylor AL等(2006)［9］首先构建了hAm慢病毒重组表达载体，转染昆虫细胞sf 9，进行瞬时表达，这种方法可以获得产量约为4～10 mg/L的rHAm。赵川江等［10］也在真核表达方面做了有益的尝试，他们重组的质粒PcDNA3.1－AMG在体外转染哺乳动物COS1细胞后能够表达。

3 rAm的结构

人的釉原蛋白基因定位于Xp22.1－p22.3和Yp11.2，其中90%X染色体转录表达，10%Y染色体转录表达［11］。人、猪的釉原蛋白基因都包含至少7个外显子(exon)，而牛的釉原蛋白基因只有6个exon，人、猪等的exon 4在转录过程中通常经过选择性剪切后被切除。另外还有研究发现在人、小鼠等的釉原蛋白基因组中存在exon 8、exon 9但缺少exon 7的一些特殊釉原蛋白基因［12］。

许多学者对重组釉原蛋白的结构进行了研究，发现rAm是一类含有亲水C端的疏水大分子［13］。Zou Y等［14］分析了重组鼠釉原蛋白M180的氨基酸组成，含有24.4%疏水性脯氨酸、13.9%谷氨酰胺和13个Gln－Pro－Xaa重复氨基酸序列，二级结构在N端A区域包括两个螺旋和一个β铰链，剩余区域为无规则卷曲，并且提示M180可能没有稳定的三级结构。关于rAm的确切结构及其功能的关系以及特定结构域的作用等方面仍不清楚。

4 rAm对牙周组织再生的作用和机制

Haze A等［15］将溶解于PGA载体的重组人釉原蛋白(rHAm)作为实验组，以单纯PGA载体为阴性对照组，以粗提的牛釉基质蛋白(EMPs)为阳性对照组，分别作用于已预先建立了牙周炎实验模型的6月龄雌性猎狗牙周组织上，通过Micro－CT和组织切片分析发现:实验组两周时首先开始有新生牙骨质形成，然后逐渐有牙周韧带和牙槽骨的再生，在4～8周后就可观察到以上3种牙周组织的明显生长，在电镜观察下可看到在新形成的牙骨质与牙周膜韧带之间有Sharpey纤维的附着，而相比较下对照组牙周支持组织则无明显的再生。Yagi Y等［16］报道:将一定浓度的重组猪釉原蛋白(rPAm)作用于SD大鼠的牙根后，在体内可抑制牙根吸收、牙骨质吸收，对促进牙周组织的再生有积极的作用。因此，rAm可以促进牙周支持组织的再生，并可以形成牙周新附着，有助于改善牙周炎病人的预后。一些研究报道证实:rAm主要由以下几种可能的机制促进牙周组织再生。

4.1 rAm对各种牙周相关细胞的作用

关于rAm对于各类牙周相关细胞的作用，许多研究都得出了相似结论:rAm作用于不同的细胞会产生不同的作用效果。Li等［17］将重组的全长猪釉原蛋白(rPAm)分别作用于牙周成纤维细胞、牙龈成纤维细胞和牙龈上皮细胞，观察对各类细胞黏附、增殖和迁移的影响，结果显示:rPAm可显著促进牙周膜成纤维细胞的增殖和迁移，且存在剂量依赖性，仅高浓度的rPAm可促进黏附;rPAm可促进牙龈成纤维细胞增殖，但抑制迁移，对黏附无明显影响;rPAm抑制牙龈上皮细胞的黏附、增殖和迁移，且与剂量相关。Hatakeyama J等［18］通过体外细胞实验发现:rPAm和LRAP(leucine－rich amelogenin peptide)可以明显刺激成牙骨质细胞和牙周膜细胞的增殖和迁移。

rAm对于各类细胞作用的具体机制和信号途径尚未完全明了，David MZ［19］的研究发现:重组鼠釉原蛋白对于牙周膜细胞可产生类生长素样作用，从而促进其黏附及增殖。另有一些研究发现:rPAm和LRAP能够发挥信号转导分子的功能，与跨膜蛋白 LAMP－1、LAMP－2以及 CD63结合，启动胞内的级联反应，从而发挥效应，并且rAm与这3个蛋白受体结合的具体结合区的氨基酸序列也有研究报道［14，20－21］。Matsuzawa M 等［22］报道:全长的重组鼠釉原蛋白可能作为信号转导分子而参与Wnt/β－catenin信号途径，从而引起对牙周膜细胞和成骨细胞的一系列效应。

4.2 rAm调节成骨和破骨细胞活性

牙槽骨是重要牙周支持组织，对成骨细胞、破骨细胞在骨的吸收、改建和再生过程中发挥着重要的作用。Svensson J等［8］用重组的鼠釉原蛋白处理原代人成骨细胞，与未经处理的成骨细胞相比，其活性有显著提高，骨钙分泌量平均提高了一倍。Miyuk等［23］研究发现:rAm可以通过抑制成骨细胞表达RANKL、M－CSF和纤连蛋白，从而下调破骨细胞的形成和活性。Hatakeyam J等［18］通过实验也得到了相似的结论。以上研究结果提示:rAm可通过上调成骨活性促进新生牙槽骨的形成;通过抑制破骨细胞的活性而降低牙根和牙槽骨的吸收，从而有利于牙周组织再生。

4.3 rAm募集多能成体干细胞

牙周组织中存在一类CD44+CD105+STRO－1+多能成体干细胞(间充质干细胞)，这类细胞可以在一定条件下分化为成骨细胞、成纤维细胞、成牙骨质细胞等，在牙周炎症控制和组织再生中发挥着重要作用［24］。体内外的实验都显示了rAm可以直接或间接作用于这类成体干细胞，招募干细胞到炎症、创伤区域促进组织愈合［15，25］。Goldberg M等［26］报道:将低分子量的重组釉原蛋白(A+4和A－4)植入小鼠的口腔黏膜，可在炎性细胞中招募间充质干细胞并促进其增殖、分化为类成骨样细胞和类成牙本质样细胞。

4.4 rAm刺激血管形成

rAm可以直接或间接地促进新生血管的形成，给予组织再生提供更好的血液供应、营养环境和物质代谢，这也是rAm促使牙周组织再生的一个可能的重要作用，但不同的实验对单一rAm是否能显著促进血管形成得出了不同的结论。Kauvar AS等［27］报道:应用真核表达体系得到的重组人釉原蛋白(rHAM+)可以在体内显著刺激发育中小鸡卵绒毛膜尿囊膜的新生血管形成，其他一些体外实验也表明rAm能够增进组织血管化［28］。但是JohnsondL等［29］将不同浓度的重组猪釉原蛋白(rPAm)作用于人微血管上皮细胞，结果在体外未能明显诱导血管形成，得出单纯rAm相比EMD不能显著促进血管形成的结论。总之大部分的研究结果倾向于rAm有利于新生血管形成，但仍需要进一步实验来验证rAm对于血管形成的具体作用和机制。

5 结束语

目前，常用的全长rAm主要有rHAm、rPAm、rMAm三种，另外还有一些低分子量的rAm剪切片段，如A－4、A+4等，具有发挥信号分子的作用。通过原核表达的方法已经可以得到稳定的rAm产量，而关于rAm真核表达的研究近年来也有很大的进展，并可能是今后表达纯化rAm的一个新的热点研究方向。虽然不少学者对rAm的基因和具体蛋白结构与其功能关系作了研究，但迄今为止仍不完全清楚。大量研究表明rAm通过对各类牙周相关细胞不同作用、调节成骨和破骨细胞活性、募集多能干细胞、刺激血管形成和作为信号分子等功能，发挥其促进牙周组织再生，利于创伤愈合的作用。但具体的效应途径和分子机制仍存在疑问，还需进一步深入研究。

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Research advance of recombinant amelogenin

LIN Zhi－kai，SHU Rong，SONG Zhong－chen
(Department of Periodontology，School of Stomatology，Ninth People＇s Hospital，School of Medicine Shanghai JiaoTong University;Institute of Shanghai Stomatology，Shanghai 200011，China)

Recombinant amelogenin(rAm)is a kind of purified protein attained by bioengineering technology methods，which can enhance periodontal regeneration.The mechanisms of rAm to promote periodontal tissue formation have not heen fully clavified.This article reviews the recent research advances of rAm in the following four aspects:classification;expression and purification;structure and mechanisms of promoting periodontal tissue regeneration.

recombinant amelogenin;regeneration of periodontal tissue;structure;function

R780.2

A

1005－2593(2011)01－0048－04

2010－08－24

林智恺(1987－)，男，汉族，上海人。硕士生(导师:束蓉)

束蓉，E－mail:shurong123@hotmail.com