王江峰， 鲁 莹， 钟延强

(第二军医大学药剂学教研室，上海 200433)

聚氨基酯作为基因载体的研究进展

王江峰， 鲁 莹， 钟延强

(第二军医大学药剂学教研室，上海 200433)

随着基因治疗研究的不断深入，寻求一种高效、安全、靶向表达的载体已成为了基因治疗的核心问题之一。聚氨基酯(poly amino ester,PAE)作为一种新型的阳离子聚合物基因载体，具有原料廉价、合成简单、结构多样、可降解、细胞毒性低和转染效率高等优点，已越来越受到人们的关注。本文将从聚氨基酯的合成途径、理化性质、聚氨基酯/DNA纳米粒的制备及聚氨基酯/DNA纳米粒转染效率和影响因素等方面详细阐述了近年来聚氨基酯作为基因载体的研究进展。

聚氨基酯；非病毒基因载体；阳离子聚合物

成功的基因治疗在很大程度上取决于是否有合适的载运系统。目前进行研究的基因载体主要有两类：病毒载体和非病毒载体。虽然病毒型基因载体由于转染效率高而被较多的应用，但病毒载体也存在着自身难以克服的局限性，诸如诱导宿主免疫反应，潜在的致癌性，制备复杂生产不能规模化，靶向性差，所能装载的外源DNA 大小有限等，使其应用受到很大限制[1,2]。因此低毒、低免疫反应、易组装、经济、便于大规模普及应用和可反复应用的非病毒型基因载体越来越成为当今研究的焦点。

阳离子脂质体和阳离子聚合物是目前广泛研究的两类非病毒型基因载体。脂质体作为常用的非病毒性载体容易制备，安全性高。但由于很难达到质控要求，且体内基因导入效率低，其应用受到限制。在阳离子聚合物型载体中的合成高分子材料，包括聚乙烯亚胺(PEI)、聚酰胺-胺(PAMAM)、聚-L-赖氨酸(pLL)，虽然转染效率较高[3～5]，但也存在着不能降解、容易在体内累积、细胞毒性大等缺点；而壳聚糖等天然高聚物虽然有很好的生物相容性，却存在着转染效率低的问题。因此寻求和发展一种同时具备高效低毒特性的阳离子聚合物作为基因载体，是现在和今后研究基因载体的一个突破点。聚氨基酯的合成以及在基因传递系统中的成功应用，正逐渐吸引中外研究者的目光。

1 聚氨基酯的合成及理化性质

1.1线性聚氨基酯的合成及其理化性质 1970年Ferruti等[6]首次报道了以二胺(bifunctional amines)和二丙烯酸酯(diacrylate esters)为原料，通过迈克尔加成反应合成了骨架中含有叔胺的线性聚氨基酯。2000年，David 等[7]首先以N,N-二甲基乙二胺、哌嗪、4,4-丙基哌啶基哌啶作为二胺，分别与1,4-丁二醇二丙烯酸酯反应生成相应的聚氨基酯并成功应用于基因的传递。聚氨基酯都能很好的溶于四氢呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇等有机溶剂中，同时还能够溶于酸性水溶液中。而通过研究发现，由于逆迈克尔加成反应的存在，聚氨基酯在生理条件下能够发生不同速度的降解。当聚氨基酯处于pH=5的环境下，降解明显减缓，当聚氨基酯处于强酸(pH<3)或强碱(pH>12)环境下几乎不发生降解。David 等[8]还以7种二丙烯酸酯和20种二胺作为原料，制备了140种线性聚氨基酯，然后进行筛选。而Akin等[9]则对反应条件进行了优化，他们以1,4-丁二醇二丙烯酸酯(或1,6-己二醇二丙烯酸酯)和4-氨基-1-丁醇为原料，在不使用反应溶剂的条件下，将反应温度提升至100 ℃ ，这样持续反应仅仅5 h就能制得相应的聚氨基酯，大大节省了反应时间。实验中发现4-氨基-1-丁醇与1,4-丁二醇二丙烯酸酯(或1,6-己二醇二丙烯酸酯)根据不同摩尔比反应生成的聚氨基酯在理化性质上有着明显的变化。当两种反应物的摩尔比越接近1时，所生成聚氨基酯的分子量越大，与此相反，无论是二胺过量还是二丙烯酸酯过量，聚氨基酯的聚合程度都会降低。在用传统的合成工艺来制备和筛选聚氨基酯的过程中，科研人员总是习惯性的在一次实验中合成一种聚氨基酯并对其性质进行试验。这样的方式在生物医学高分子材料的合成筛选中应用相当普遍，但是却相当费时。因此Daniel等[10]采用了半自动化的高通量合成法来合成聚氨基酯，并一次性对2 350种聚氨基酯进行了筛选。

1.2支链聚氨基酯的合成和理化性质 由于线性聚氨基酯的结构中只有叔胺的存在，因此大多数的线性聚氨基酯对DNA的包裹能力并不理想。而支链聚氨基酯作为基因载体相对于线性聚氨基酯来说存在着众多的优势：首先支链聚氨基酯的水溶性要比线性聚氨基酯效果要好；其次支链聚氨基酯中存在着伯胺，能更好的包裹DNA，而且粒径也明显小于线性聚氨基酯包裹DNA所形成的纳米颗粒；此外高密度的叔胺和仲胺使得支链聚氨基酯有了更大范围的pH缓冲能力；最后由于伯胺和仲胺的存在，使得可以更方便地进行结构修饰。制备支链聚氨基酯的方法一般有两种：①二丙聚氨基酯烯酸酯与多胺反应；②二胺与多丙烯酸酯反应。Zhong等[11]采用二丙烯酸酯与多胺反应的方法，以N-甲基乙烯基二胺、1 -(2 -氨乙基)哌嗪、4-(氨甲基)哌啶与乙二醇二丙烯酸酯、1,4-丁二醇二丙烯酸酯、1,6-己二醇二丙烯酸酯为原料反应生成多种支链聚氨基酯。而Tae-il等[12]则是以N,N-二甲基已二胺和季戊四醇三丙烯酸酯为原料，采用二胺与多丙烯酸酯反应的方法制备支链聚氨基酯。除此以外也有少数研究人员不采用迈克尔加成反应的方法来制备支链聚氨基酯，比如Hyun等[13]就是应用特殊的化合物以酯化反应合成相应的聚氨基酯。

在一定范围内，反应时间的长短与支链聚氨基酯分子量的大小存在着一定关系，反应时间越长，分子量就越大。支链聚氨基酯在水中的降解速度同样跟pH值有关，生理条件下的降解速度要快于酸性条件下的降解速度，和亲水性有关。此外，支链聚氨基酯的降解速度还跟亲水性有关，亲水性高的支链聚氨基酯降解速度更快。此外，支链聚氨基酯在pH5.1～7.4直接具有更强的酸碱缓冲能力。

2 聚氨基酯纳米粒的制备及纳米粒的基本特征

为了保护DNA避免酶解并增加有效吸收，将DNA复合成粒子是有效传递和转染基因至关重要的一环，因此阳离子聚合物作为非病毒基因载体的第一步是将其有效包裹形成一种稳定均一的载基因纳米粒[14,15]。目前聚氨基酯纳米粒的制备方法主要有复凝聚法和自组装法。而聚氨基酯载基因纳米粒主要采用的是后者，即通过聚氨基酯表面的阳电荷与基因所带的负电荷相互吸引，自发形成纳米粒。

大多数聚氨基酯载基因纳米粒的粒径在150 nm以下，粒子表面带正电荷。影响聚氨基酯载基因纳米粒生物物理学特征的因素包括N/P比、聚氨基酯分子量、聚氨基酯化学结构和pH值等[16]。在一定范围内，随着N/P比的增大纳米粒粒径会逐渐减小，而ζ电位则逐渐增大。聚氨基酯分子量的大小影响聚氨基酯对DNA的亲合力，当聚氨基酯分子量小于11 kDa时，即使质量比达到150:1，都不能很有效的浓缩和包裹DNA，当聚合物分子量大于13 kDa时，质量比在10:1左右，就能很好的包裹DNA。在相同N/P比时，聚氨基酯分子量愈大，相同条件下制得纳米粒粒径愈小，ζ电位相对愈大，这也说明大分子量的聚氨基酯能够更有效的包裹DNA。而聚氨基酯的化学结构则是影响聚氨基酯有效包裹DNA最主要的原因，在Daniel等[10]所筛选的2 350种聚氨基酯中，绝大部分的聚氨基酯并不能完全包裹住DNA，有的聚氨基酯纳米粒的粒径达到数千纳米，有的聚氨基酯纳米粒的ζ电位则为负值。此外，当聚氨基酯的单体为氨基醇和疏水性丙烯酸酯时，纳米粒的粒径则是最小的，同时转染效率也是最高的。聚氨基酯纳米粒一般是在酸性缓冲溶液中制备，如果将纳米粒转移至pH 7.4的环境下，纳米粒粒径会明显增大。

在进行体外细胞转染实验中，非病毒载体的转染通常是在无血清培养基中进行，因为在血清存在情况下，非病毒载体制剂的转染效率会很低[17]。Jordan等[18]将粒径小于150 nm聚氨基酯纳米粒置于含血清的溶液后发现，所有纳米粒的粒径发生了显著的变化。其中少数粒子粒径突增到200 nm后保持相对稳定；而多数粒子发生了聚集，粒径达到微米级，甚至有一些粒子的表面电荷由原来的正电荷变成了负电荷，造成这种现象的原因可能是由于带负电荷的血清蛋白吸附到带正电荷的纳米粒粒子表面，致使整个纳米粒表面呈荷负电荷特征。有趣的是，纳米粒粒径和ζ电位在血清中的改变和聚氨基酯单体化合物的单个原子改变有关。这更进一步证明了聚氨基酯的化学结构是聚氨基酯载基因纳米粒生物物理学特征的主要影响因素。

3 聚氨基酯/DNA纳米粒转染效率及影响因素

3.1转染机制 阳离子聚合物与DNA通过电荷作用形成稳定的阳离子聚合物/DNA复合物，经过运输，纳米粒达到靶细胞后，纳米粒子与靶细胞表面的阴离子蛋白聚糖等相互作用，通过内吞入胞等方式被转运至细胞内，阳离子物质在酸性的吞噬囊泡内聚集，增加内吞泡的pH值，从而抑制DNA被溶酶体酶降解，同时还可引起质子的内流，使内吞泡囊失去稳定，DNA释放到细胞质中，DNA随之通过核孔或在核定位信号介导下进入细胞核，并离开阳离子载体解缩合而复原成生物活性的DNA，进而发挥效应[19]。PEI具有很高的细胞转染效率是因为它能通过质子海绵机制(“proton sponge” mechanism)直接实现基因的核内体逃逸。而Akin等[20]通过标有pH敏感荧光和非pH敏感荧光的双标DNA表明聚氨基酯对基因的转染同样跟质子海绵机制有关。

3.2聚氨基酯与DNA之间的亲和力对转染效率的影响 Daniel等[10]采用半自动化的高通量合成法合成聚氨基酯，并对合成的2 350种聚氨基酯进行筛选后发现，其中有46种聚氨基酯的转染效率要高于PEI，而绝大多数的聚氨基酯的转染效率并不十分理想，显然这与不同聚氨基酯之间不同化学结构有着密切的联系。聚氨基酯化学结构的差异，表现为聚氨基酯和DNA之间亲合力的不同。聚合物和DNA之间的亲合力有助于粒子的稳定性，从而能够保证DNA始终受到保护而不被酶解，同时也能够提高细胞摄取率。但是考虑到聚合物跟DNA之间的亲合力太强，纳米粒包裹太紧密，DNA有可能不易从纳米粒中释放出来，而降低转染效率。有报道指出，当多聚赖氨酸分子链超过一定长度之后，多聚赖氨酸载基因复合物会明显阻碍RNA的合成，从而降低了转染效率[21]。同样，PEI在分子量为25 kDa时具有最佳转染效率，分子量的进一步增大并不能提高它的转染效率[22]。但是笔者也发现当聚氨基酯的分子量小于8 kDa的情况下，其转染效率相对较低。因此聚合物/DNA之间的亲合力跟转染效率之间存在着一种微妙的关系，亲合力太大或者太小都不能使基因转染达到最佳状态。

3.3聚氨基酯末端基团对转染效率的影响 聚氨基酯末端基团的改变对转染效率也有着很大的影响。如果在聚氨基酯合成过程中丙烯酸酯过量(以酯基封端)，那么其转染效率要远远低于以胺基封端的聚氨基酯。以含有羟基或者额外胺的亲水性胺基封端的聚氨基酯具有最佳的转染效率；相反，如果封端基团是含有烷基或者芳香基团的疏水性胺基，那么该聚氨基酯具有很低的转染效率[23]。

3.4聚氨基酯载基因纳米粒的非特异靶向性 载基因纳米粒形成后，细胞对纳米粒的有效摄取是决定转染效率的关键。细胞摄取可分为靶向性和非特异靶向性。对于非特异靶向性细胞摄取，最重要的是纳米粒粒子表面呈正电荷，这样纳米粒就可通过静电吸附跟带负电荷的细胞表面蛋白结合，从而被转运到细胞内。纳米粒粒径的大小也是影响细胞摄取的重要因素之一，粒径越小越易于细胞摄取，当粒径在100 nm左右时，细胞摄取达到最佳状态。事实上，粒径大小对转染效率的影响一直存在着争议。因此，转染效率的大小应该把粒子粒径、电势电位和聚合物分子量等诸多因素一起加以考虑。比如对于体外细胞实验来讲，大粒径的纳米粒可以更好的沉积并提高转染效率；但对于体内实验来说，大粒径的纳米粒很容易被巨噬细胞吞噬，不能有效的运输至有效位点[18]。

3.5聚氨基酯载基因纳米粒的特异靶向性 Langer实验室采用了两种方法来实现聚氨基酯载基因纳米粒制剂的靶向性。第一种方法是Gregory等[24]以2-(硫代吡啶)乙胺为胺单体合成聚氨基酯，这样聚氨基酯侧链中的硫代吡啶就可以与巯基化的RGD蛋白等配体结合，使其具有靶向性。但是这样的方法存在着一定的缺陷，靶向配体的共价键连接改变了纳米制剂的生物物理学特征。在实验中发现，随着配体取代率的提高，聚氨基酯对基因的转染效率会有略微的下降，导致这种现象的原因可能是配体的连接使得聚氨基酯原有的化学结构和空间结构发生了改变，从而改变了聚氨基酯的核内体缓冲能力和对DNA的浓缩能力。为了使聚氨基酯纳米粒在具有靶向性的同时，又不改变聚合物原来的化学功能学结构，Jordan等[25]采用静电吸附的方法，使带负电荷的蛋白配体自发的吸附包裹在带正电荷的纳米粒子表面，形成粒径在100～200 nm之间的稳定的具有靶向性的载基因纳米粒。通过透射电镜观察，该纳米粒在血清存在的环境下仍非常稳定，这说明以该方式形成的靶向纳米粒由于其表面电荷由原来的正电荷调节为近中性，从而能够降低非特异性基因传递并减少纳米粒与潜在的血清蛋白的相互作用。实验结果也显示该载基因纳米的转染效率要远远高于相对应的非靶向性聚氨基酯载基因纳米粒。

4 结束语

聚氨基酯作为一种新型的阳离子聚合物基因载体，具有多方面的优点：①聚氨基酯含有在酸性和生理条件下带阳离子的氨基，能与带负电荷的DNA缩合成稳定的纳米粒；②聚氨基酯含有能够降解的酯键，跟其它阳离子聚合物相比细胞毒性小；③聚氨基酯化学结构多样性，合成聚氨基酯的原料可以直接购买得到，合成工艺简单方便；④无论是体内还是体外，转染效率高。同时，也可以通过聚氨基酯末端基团的修饰以及聚氨基酯载基因纳米粒靶向配体的修饰来进一步提高转染效率。此外，半自动化高通量合成法筛选聚氨基酯的方法，也能借鉴运用于其他高分子材料或药物筛选实验中去。

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2010-08-02

[修回日期] 2010-10-12

Researchonpolyaminoesterasthegenevector

WANG Jiang-feng, LU Ying，ZHONG Yan-qiang

(Department of pharmaceutical, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)

With the deepening research of gene therapy, to find an efficient, safe, targeted expression gene vector had become one of the core issues of gene therapy. Poly amino ester (PAE) as a new type of cationic polymer gene carriers, with cheap raw materials, simple synthesis, diversity structure, biodegradability, low toxicity and high efficiency transfection, which had attracted lots of researchers' focus. Recent research of PAE as a gene vector from the poly amino ester synthesis pathway, physical and chemical properties, properties of poly amino ester / DNA nano-particles and transfection efficiency of polyamino ester/DNA nano-particles were summarized in this paper.

poly amino esters; non-viral gene vector; cationic polymer

王江峰(1984-)，男，硕士研究生.E-mail:air008@163.com.

钟延强. Tel：(021)81871285, E-mail:yqzhong@smmu.edu.cn.

R943

A

1006-0111(2011)03-0165-04