张雁冰， 张全海， 张赛扬， 马 刚， 毕跃峰， 符 玲

(郑州大学 药学院 新药研究开发中心 河南 郑州 450001)

皇冠果壳中皇冠苷A的提取工艺优化及含量测定

张雁冰， 张全海， 张赛扬， 马 刚， 毕跃峰， 符 玲

(郑州大学 药学院 新药研究开发中心 河南 郑州 450001)

用HPLC方法测定了皇冠果壳中皇冠苷A的含量，确定了HPLC法测定皇冠苷A含量的条件.测定结果为：皇冠果壳中皇冠苷A的含量不低于16.47 g/kg.用正交试验优化了皇冠果壳中皇冠苷A的提取工艺，结果表明其理论最佳提取工艺条件为：用体积分数55%的乙醇提取2次，每次提取1 h，每次所用乙醇的体积为皇冠果壳质量的20倍.

HPLC； 皇冠苷A； 正交试验； 工艺优化； 含量测定

0 引言

植物皇冠(Mahkotadewa)，属瑞香科，主要分布于印度尼西亚.在当地，皇冠的叶子、果实和树皮广泛用于治疗肝炎、癌症、心脏病、糖尿病和关节炎等多种疾病，具有显著的疗效，所以皇冠有“药王”、“帝王仙树”的美誉[1-6].对皇冠果壳的化学成分进行研究，发现其含有大量的皇冠苷A，关于其含量测定及提取工艺的文献尚未见报道.作者建立反相高效液相法(HPLC)测定皇冠果壳中皇冠苷A的方法，并优化了提取工艺，为进一步研究植物皇冠提供科学依据.

1 材料和方法

1.1材料

皇冠果壳(西北农林科技大学林业系张文辉教授鉴定)，皇冠苷A对照品(本实验室提供)，乙腈(一级色谱纯，天津市四友精细化学品有限公司)，其他试剂均为分析纯.

1.2主要仪器

UV-2550紫外分析仪(日本岛津公司)；LC-2010A高效液相色谱仪(日本岛津公司)； Kromasil色谱柱(C18，5u，250 mm×4.6 mm)；奥利龙868台式pH计；浩鹏ST-04A多功能粉碎机.

图1 皇冠苷A的紫外吸收图谱Fig.1 The UV absorption spectra of Mahkoside A

1.3皇冠苷A的HPLC含量测定方法

1.3.1皇冠苷A的紫外吸收 精密称取0.001 0 mg皇冠苷A对照品于100 mL容量瓶，甲醇定容.以甲醇作为空白溶液，对其进行200～400 nm波长的紫外吸收扫描,结果如图1所示，皇冠苷A的最大吸收波长为293 nm，因此将HPLC的检测波长选定为293 nm.

1.3.2色谱条件 选用Kromasil色谱柱分离，流动相为乙腈-0.05 mol/L磷酸(三乙胺调pH为3.60)-水(体积比20∶1∶79)，检测波长为293 nm，柱温为25 ℃，流速为 1 mL/min，进样量为20 μL，在此条件下，皇冠苷A的理论塔板数不低于3 500，对照品的HPLC如图2所示，皇冠苷A在此色谱条件下，出峰时间为5.931 min，峰型良好.

图2 皇冠苷A的HPLC图Fig.2 The HPLC spectra of Mahkoside A

1.3.3对照品溶液的配制 精密称取105 ℃干燥至恒重的皇冠苷A对照品0.039 0 g，置于25 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，静置.然后分别精密量取1，2，3，4，5 mL于25 mL容量瓶中，用水定容至刻度，作为对照品溶液.

1.3.4线性关系 以皇冠苷A的峰面积为纵坐标，对照品溶液的浓度为横坐标进行线性回归，得到回归方程：y=5×107x-75 911,r=0.999 4(n=5)，线性关系较好.

1.3.5供试品溶液的配制 根据预试验结果，每次提取时间确定为1 h，选取乙醇的体积分数、提取次数和单位质量干燥药材所用乙醇体积3个试验因素，每个因素3个水平进行优选.用多功能粉碎机将5.00 g皇冠果壳粉碎至纤维状，按照正交试验方案进行加热回流提取，冷却后过滤，将滤渣和滤液分离，然后用水将滤液稀释至250 mL，摇匀，取600 μL于25 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀静置，待用.

1.3.6稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于2，4，6，8，10，12 h进样，对皇冠苷A的峰面积进行考察，RSD为0.196%(n=6)，说明供试品溶液在12 h内稳定性较好.

1.3.7精密度试验 对质量浓度为0.274 56 g/mL的皇冠苷A对照品溶液连续进样5次，其峰面积的RSD为0.238%(n=5).

1.4皇冠苷A提取工艺的优化及含量测定

吸取1.0 mL供试品溶液经微孔滤头过滤后于进样瓶中，在上述色谱条件下进样，随机选取4组样品,结果如图3所示，皇冠苷A的峰型对称，与其他峰分离良好，分离度在3.0以上，理论塔板数均在7 000以上.

图3 部分样品的HPLC图Fig.3 HPLC analysis of some samples

每组样品进样3次，取平均值，把皇冠苷A 的峰面积按照标准曲线的回归方程进行线性回归，求得样品溶液的浓度，进而求出皇冠果壳中皇冠苷A的质量分数，其结果见表1和表2.

表1 正交试验方案及结果

表2 极差分析表

2 结果

1)HPLC法测定皇冠苷A的实验条件为：Kromasil柱分离，流动相为乙腈-0.05 mol/L磷酸溶液(三乙胺调pH为3.60)-水(体积比20∶1∶79)，检测波长为293 nm，柱温为25 ℃，流速为1 mL/min.

2)皇冠果壳中皇冠苷A的含量不低于16.47 g/kg.

3)由表1和表2可以看出，各因素的影响程度为B>C>A，因此，皇冠果壳中皇冠苷A的理论最佳提取工艺为B2C3A3，即用体积分数55%的乙醇提取2次，每次提取1 h，每次所用乙醇的体积为皇冠果壳质量的20倍.

3 讨论

1)选定的流动相对皇冠苷A与其他物质有良好的分离效果.皇冠苷A在对照品溶液中的平均出峰时间约为5.93 min，而在药材提取液中的平均出峰时间为6.03 min，可能是提取液中的其他物质影响所致，属于正常误差.

2)根据正交试验的结果可知，关于溶剂体积这一因素，改变C2(16倍)为C3(20倍)能够提取出更多的皇冠苷A，但增幅不大，故在实际操作中，考虑成本和效率，建议的提取工艺为B2C2A3，即用体积分数55%的乙醇提取2次，每次所用乙醇的体积为皇冠果壳质量的16倍.

结果表明，本实验所建立的HPLC法测定皇冠苷A含量，方法准确、快速、专属性强、灵敏度高、重现性好.

[1] Zhang Yanbing,Xu Xiangjun,Liu Hongmin．Chemical constituents fromMahkotadewa[J]．Journal of Asian Natural Products Research,2006,8(1/2):119-123.

[2] 张雁冰，徐向军，井云环，等．皇冠果中挥发油成分分析[J]．郑州大学学报:理学版，2006，38(2)：84-86.

[3] 徐向军，左玲霞，祁伟宏，等．皇冠果籽化学成分的分离提取[J]．化工时刊，2006，20(9)：45-47.

[4] Oshimi S,Zaima K,Matsuno Y,et al．Studies on the constituents from the fruits ofPhaleriamacrocarpa[J]．Journal of Natural Medicines，2008，62(2)：207-210.

[5] Ferrari J,Terreaux C,Sahpaz S,et al. Benzophenone glycosides fromGnidiainvolucratea[J]．Phytochemistry,2000,54(8):883-889.

[6] Hendra P,Fukushi Y,Hashidoko Y. Synthesis of benzophenone glucopyranosides fromPhaleriamacrocarpaand related benzophenone glucopyranosides[J]．Biosci Biotechnol Biochem,2009,73(10):2172-2182.

OptimizationoftheExtractionTechnologyandDeterminationofMahkosideAinNutShellofMahkotadewa

ZHANG Yan-bing, ZHANG Quan-hai, ZHANG Sai-yang, MA Gang, BI Yue-feng, FU Ling

(NewDrugResearchandDevelopmentCenter,SchoolofPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China)

The content of Mahkoside A in nut shell ofMahkotadewawas determined by HPLC method.The results indicated that the content of Mahkoside A was not less than 16.47 g/kg. The extraction process for Mahkoside A in nut shell ofMahkotadewawas selected through orthogonal test,and the optimum extraction process was as follows: adding 20 times amount of 55% alcohol into medical materials,and refluxing and extracting for 2 times，each time for 1 h.

HPLC;Mahkoside A;orthogonal test;technology optimization;content determination

R 284.2;R 927.2

A

1671-6841(2011)04-0077-04

2011-04-01

张雁冰(1958-)，女， 教授， 博士，主要从事天然产物化学研究，E-mail:zhangyb@zzu.edu.cn.