吴伯智， 谢 珣， 赵冬芹， 蔡昭林， 杨美燕， 李楚华

(华南师范大学生命科学学院，广东省植物发育生物工程重点实验室，广东广州 510631)

远志(PolygalatenuifoliaWilld)是一种常见中药，有安神益智、祛痰、消肿等功效[1].远志皂苷(polygala tenuigenin)系远志的主要有效成分之一.本实验室前期工作观察了以远志、五味子为主要配方的益智Ⅱ号对小鼠突触结构的影响，发现益智Ⅱ号能使突触功能增强，轴棘穿孔突触增多[2]；益智Ⅱ号和远志提取物均能延长小鼠的记忆，延缓记忆的消退[3].远志皂苷能提高去卵巢动物的学习记忆能力，并增加NOS阳性神经元的表达[4].上述资料均显示远志及远志皂苷能改善动物的学习记忆功能.关于远志皂苷提高学习记忆能力的相关机制，可能与抑制脑内胆碱酯酶活性有关[5-7]，然而在海马CA3突触形态方面，却未见有文献报道.而突触形态的可塑性是脑高级功能，尤其是学习记忆的结构基础.本实验通过迷宫训练观察远志皂苷对小鼠行为习得的影响，并从突触形态结构方面探讨远志皂苷的作用机制，为远志皂苷的开发应用提供实验依据.

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

实验动物为2月龄昆明品系雄性小鼠，清洁级，30只，体质量22±2 g，由中山大学中山医学院动物实验中心提供(许可证号为SCXK(粤)2004-0011)，随机分为对照组和远志皂苷组.根据分组情况，远志皂苷组每只小鼠灌胃生药剂量为4.50 g/kg的远志皂苷溶液，对照组动物则灌胃等剂量的生理盐水，持续24 d.给药14 d后进行行为学训练，训练结束后，每组随机各取7只小鼠进行突触形态观察.

小鼠饲养环境温度为25±1℃，自然光照，给予充足的饮水和摄食.根据刘友平等[8]的方法改进远志皂苷制备，其纯度为87.48%，由广东药学院鉴定.

1.2 行为训练

训练模型为三等分辐射式迷宫箱.检测指标为每实验日的正确反应率及达学会标准所需的训练次数.采用固定次数随机不休息法：安全区以无规则的顺序变换.小鼠受电击后从起步区直接到安全区为“正确反应”，反之为“错误反应”.小鼠每天训练10次，2次训练时间间隔为20～30 s.当正确反应率≥90%时，表明动物达到学会标准(达标).电击强度为25～50 V，所有行为训练均在晚间暗条件安静环境中进行.

1.3 电镜观察

1.3.1 样品的制备 取脑固定.按透射电镜常规制样方法处理组织块，EPON812包埋，LKB超薄切片机切片，柠檬酸铅和醋酸铀双染色，Hitach 7500透射电镜下观察切片.

1.3.2 指标测试 在电镜下选择Gray-I型兴奋突触拍片.每个样品随机选取4～6张电镜照片，应用Image-Pro Plus 6.0软件进行测量和统计.突触活性带长度的测定按罗兰等(1990)的方法(图1)进行.突触间隙采用多值平均法，突触数密度(PSD)与穿孔突触比例统计：突触计数依据JONES等(1991)所确定的标准.立体学方法定量分析突触的数密度(Nv)，所用公式为：Nv=8ENa·(π2)-1(Na为单位面积中的突触数量，E为PSD长度倒数的平均值).

图1 突触活性带和PSDFigure 1 Synaptic active zone and postsynaptic density

1.4 数据统计

2 结果与分析

2.1 远志皂苷对小鼠行为习得的影响

2.1.1 对小鼠每日行为训练正确反应率的影响 表1所示，行为训练使各组小鼠每天的正确反应率均逐渐升高.远志皂苷组的正确反应率均高于相应的对照组；训练第4～8天，远志皂苷组小鼠的正确反应率显著高于对照组小鼠(P<0.05)；第7天远志皂苷组小鼠已达学会标准，而对照组小鼠直至第9天才达学会标准.第9～10天2组小鼠均已达学会标准，2组小鼠在正确反应率上没有显著性差异.

2.1.2 对小鼠行为达标所需训练次数的影响 图2所示，经过10 d的行为训练，所有小鼠均达学会标准.远志皂苷组小鼠达标所需的训练次数为68.70±18.72，明显低于对照组的89.30±17.59(P<0.05).

表1远志皂苷对小鼠正确反应率的影响(n=15) %
Table 1 Effect of polygala tenuigenin on the correct response rate in mice(n=15)

DayControlPolygala tenuigenin153.00±15.6763.00±15.67264.00±15.7868.00±15.49371.00±11.9773.00±13.37473.00±17.6785.00±9.72a576.00±18.3888.00±11.97a675.00±9.7289.00±11.74b783.00±14.1893.00±18.28a884.00±17.7695.00±5.27a992.00±11.3595.00±8.501091.00±15.2497.00±5.27

注：a:P<0.05，b:P<0.01(下同)

图2 远志皂苷对小鼠行为达标所需训练次数的影响(n=15)Figure 2 Effect of polygala tenuigenin on the training number of reaching standard in mice (n=15)

2.2 远志皂苷对小鼠海马CA3区突触形态的影响

表2和图3～图7所示.在相同视野下，远志皂苷组小鼠海马CA3区突触数密度增大(P<0.01)，穿孔突触增加(P<0.05)，以不对称突触为主.与对照组比较，奕融活性带增长(P<0.05)，突触间隙变窄(P<0.01)，PSD明显增厚(P<0.01).显示远志皂苷能影响海马CA3区突触数目与相关的形态特征.

表2远志皂苷对小鼠海马CA3区突触形态结构的影响(n=30)
Table 2 Effect of polygala tenuigenin on synaptic morphology of hippocampal CA3in mice(n=30)

ItemsControlPolygala tenuigeninLength of active zone/nm200.41±38.26223.68±42.40aWidth of synaptic clef/nm13.32±1.8310.90±1.10bThickness of PSD/nm51.65±11.2658.97±8.02bNv of synapses/(N·(μm3)-1)0.79±0.100.98±0.11bPercentage of perforated synapses/%3.705.26a

图3 远志皂苷对小鼠海马CA3区突触数量的影响(×20 000)Figure 3 Effect of polygala tenuigenin on synaptic density of hippocampal CA3 in mice (×20 000) 注：箭头所指为突触

图4 远志皂苷对小鼠海马CA3区穿孔突触的影响(×20 000)Figure 4 Effect of polygala tenuigenin on perforated synapses of hippocampal CA3 in mice (×20 000) 注：箭头所指为穿孔突触

图5 远志皂苷对小鼠海马CA3区PSD厚度的影响(×70 000)Figure 5 Effect of polygala tenuigenin on PSD of hippocampal CA3 in mice (×70 000) 注：箭头所指为PSD

图6 远志皂苷对小鼠海马CA3突触间隙宽度的影响(×70 000)Figure 6 Effect of polygala tenuigenin on synaptic clef of hippocampal CA3 in mice (×70 000) 注：箭头所指为突触间隙

图7 远志皂苷对小鼠海马CA3突触活性带长的影响(×70 000)Figure 7 Effect of polygala tenuigenin on active belt length of hippocampal CA3 in mice (×70 000) 注：箭头所指为突触活性带

3 讨论

根据前期工作的结果[4]确定了2.25、4.50、9.00 g/kg的生药剂量，连续给小鼠进药24 d.以剂量为4.50 g/kg的生药质量分数益智效果最为明显，因此本实验选择4.50 g/kg为用药质量分数.

3.1 远志皂苷对小鼠行为习得的影响

远志皂苷对小鼠的行为习得具有明显的提高作用.张耀春等[9]发现远志提取物均能不同程度提高东莨菪碱、亚硝酸钠、电休克和自然衰老所致的学习记忆障碍模型小鼠的学习记忆功能.金国琴等[10]研究调心方(主药包括党参、远志、桂枝等)防治阿尔茨海默病(AD)的作用，指出药能有效改善AD大鼠空间学习记忆障碍.研究表明，远志皂苷能够通过抑制β分泌酶的活性，抑制体外培养的成神经细胞分泌Aβ[11]；远志皂苷对丙酮醛诱导的细胞毒性表现出抗细胞凋亡和抗氧化性，抑制丙酮醛诱导的细胞凋亡蛋白酶的活性、清除细胞内活性氧簇[12].在本研究中，远志皂苷提高小鼠的学习能力是否与其抗凋亡或抗氧化相关，有待进一步的探讨.此外，有文献报道，远志皂苷可使Aβ1～40模型皮层神经元突起数目明显增多、神经元突起长度明显伸展[13].一般认为，行为的可塑性与突触的可塑性密切相关.而突触可塑性包括突触形态结构的变化.那么，远志皂苷对学习记忆的促进作用是否与突触形态的改变有关？由于远志皂苷对突触形态的影响尚未见有报道，因此本研究在行为学的基础上，进一步研究远志皂苷对突触形态的影响.

3.2 远志皂苷对小鼠海马突触形态的影响

海马在情绪、学习和记忆活动中具有重要作用.海马结构内部联系主要是三突触环路，而CA3区在学习与记忆中起着重要作用，这是本实验选择观察海马CA3区突触形态的依据.

本实验结果表明：远志皂苷能使小鼠海马CA3区的突触密度显著增大，穿孔突触增加，活性带增长，突触间隙变窄，PSD明显增厚.

GEINISMAN等发现老年大鼠的海马齿状回穿孔突触显著减少.突触穿孔现象可能是突触分裂的中间步骤，突触穿孔后PSD 变为节段性，出现多个活性区，使得不同受体簇的不同活性区传递功能大大加强，进一步增强了突触传递功效.也有人认为穿孔现象常出现于结构复杂的大突触中，而且各种刺激会使小突触变大[14].总之，突触穿孔现象与突触的功能状态有关，功能越复杂的脑区，穿孔突触的比例越多，是突触可塑性的重要表现之一.研究发现远志提取物可以使体外培养的神经元轴突增长[15].那么，远志皂苷是否也可促进在体小鼠神经元轴突的增长？另有报道指出，远志皂苷可促进CA1区神经元干细胞的增殖[16].那么，远志皂苷对CA3区神经元的增殖或凋亡是否有影响？其影响是否与突触可塑性有关？仍有待研究.

ZIFF认为PSD 在突触后的发育及功能活动依赖区的可塑性中有重要意义[17].环境因素的刺激，如药物、训练等可引起脑部不同区域的PSD 厚度的变化.而突触间隙宽度的增大，可使递质到达突触后膜的时间延长，增加递质失活的机会，从而使突触传递的效率下降.在本实验中，远志皂苷使海马神经元PSD厚度明显提高，突触活性带增长，这些变化必将促进PSD的生化反应及突触传递效率，提高小鼠的学习能力.而突触间隙宽度却明显变小，有利于神经递质的有效传递.

综上所述，远志皂苷能明显提高小鼠的学习能力.此外，远志皂苷还能使突触形态结构产生相应的变化.从而推测远志皂苷可能通过改变突触可塑性而起益智作用.

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